Universität zu Köln

Scholten, Julia (2009). Novel tools for mast cell research: Mast cell-specific Cre-mediated gene inactivation and inducible ablation of mast cells in vivo. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Mast cells are well known effector cells in allergic disorders. In the recent years, however, mast cells were demonstrated to play pivotal roles in initiating and modulating innate and adaptive immune responses. The animal models available until today for the investigation of mast cell functions are primarily the Kit-mutant KitW/Wv and KitWsh/Wsh mouse strains. These mice are devoid of mast cells and can be reconstituted with mast cells from gene deficient mice. The phenotypic abnormalities, apart from mast cell deficiency, e.g. the profound perturbation of the hematopoietic system, however, limit the utility of these strains. Aiming at new models of mast cell-specific gene inactivation in vivo and of mast cell-deficiency, the Cre/loxP system was applied to allow Cre-mediated mutagenesis selectively in mast cells. BAC (bacterial artificial chromosome) transgenic animals were successfully generated that display Cre expression under the control of either the Mcpt5 or Mcpt6 promoter. Cre-mediated recombination as assessed by reporter gene expression in Mcpt5-Cre or Mcpt6-Cre R26R-EYFP double positive mice was found to be highly efficient in peritoneal and skin mast cells, but was not found in hematopoietic cell populations other than mast cells. Thus, the new mast cell-specific Cre transgenic mouse lines will provide useful tools for the investigation of mast cell-specific functions of individual genes. Furthermore, the Mcpt5-Cre strain was used to establish a new model for inducible ablation of mast cells in adult mice. By crossing this line to the iDTR strain, which expresses the high affinity diphtheria toxin receptor (DTR) after Cre-mediated deletion of a stop element, mast cells were rendered diphtheria toxin (DT) sensitive. DT treatment of Mcpt5-Cre iDTR double positive mice resulted in successful ablation of connective tissue type mast cells (CTMC), but not of mucosal mast cells (MMC). The depletion of CTMC resulted in significant reduction of a passive, systemic anaphylactic response demonstrating that this system for mast cell ablation represents a useful model for the investigation of mast cell functions during immune responses. Interestingly, the repopulation of the peritoneal cavity and the skin with mast cells after DT-mediated mast cell depletion followed a very slow kinetic with a noteworthy recurrence of peritoneal mast cells three months after DT treatment. Skin mast cells do not return significantly within a period of four months. Thus, the long persistence of the mast cell-depleted state allows the application of this system for long-term experiments and should provide new insights into the mechanisms of mast cell homeostasis and recruitment.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Neue Möglichkeiten für die Mastzell-Forschung: Mastzell-spezifische Cre-vermittelte Gen-Inaktivierung und induzierbare Depletion von Mastzellen in vivo German
Translated abstract:	Abstract Language Mastzellen sind vor allem bekannt als Effektorzellen allergischer Erkrankungen. In den letzten Jahren wurde jedoch gezeigt, dass Mastzellen entscheidend zu der Mobilisierung und Modellierung von angeborenen und adaptiven Immunantworten beitragen. Die derzeitig verfügbaren Modelle für die in vivo-Analyse von Mastzellfunktionen, sind vorwiegend die Kit-mutierten, Mastzell-defizienten KitW/Wv und KitWsh/Wsh Mäuse, die mit in vitro differenzierten Mastzellen von Gen-defizienten Mäusen rekonstituiert werden können. Phänotypische Abnormitäten zusätzlich zu der Mastzell-Defizienz, z. B. Störungen des hämatopoietischen Systems, erschweren jedoch das Experimentieren und die Interpretation der Daten. Aus diesem Grund wurde hier das Cre/loxP-System herangezogen, um in vivo Gene gezielt in Mastzellen zu inaktivieren und um neue Modelle für Mastzell-Defizienz zu generieren. BAC (bacterial artificial chromosome) transgene Mauslinien wurden erfolgreich hergestellt, die die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des Mcpt5- bzw. Mcpt6-Promotors ausprägen. In Mcpt5-Cre bzw. Mcpt6-Cre R26R-EYFP doppelt positiven Mäusen konnte eine höchst effiziente, Cre-mediierte Rekombination in Mastzellen der Peritonealhöhle und der Haut, jedoch nicht in anderen Zellpopulationen, nachgewiesen werden. Die neuen Mastzell-spezifischen Cre-transgenen Mauslinien werden daher in Zukunft die Untersuchung Mastzell-spezifischer Funktionen einzelner Gene erheblich erleichtern. Des Weiteren wurde die Mcpt5-Cre Linie für die Etablierung eines neuen Models für induzierbare Ablation von Mastzellen in vivo verwendet. Die Kreuzung dieser Linie mit dem iDTR Mausstamm, der den hoch affinen Diphtherietoxin Rezeptor (DTR) nach Cre-mediierter Deletion eines Stop-Elements ausprägt, führt zu einer Sensibilisierung von Mastzellen gegenüber dem Diphtherietoxin (DT) in Mcpt5-Cre iDTR doppelt positiven Tieren. Die Behandlung mit DT resultierte in einer effizienten Depletion von Bindegewebsmastzellen (CTMC), jedoch nicht von mukosalen Mastzellen (MMC). Die Ablation der CTMC reichte aus, eine passive, systemische anaphylaktische Reaktion signifikant zu reduzieren, was demonstriert, dass das System der induzierbaren Mastzell-Ablation ein geeignetes Modell für die Erforschung von Mastzell-Funktionen darstellt. Interessanterweise folgte die Repopulation der Bauchhöhle und der Haut mit Mastzellen einer höchst langsamen Kinetik. Ein signifikanter Anstieg der Mastzell-Zahlen in der Bauchhöhle zeigte sich erst drei Monate nach Depletion. Eine deutliche Rückkehr der Hautmastzellen war auch nach vier Monaten noch nicht zu beobachten. Folglich erlaubt die langfristige Depletion der Mastzellen die Anwendung dieses Systems in Langzeitexperimenten und kann, des Weiteren, neue Einblicke in die Mechanismen der Homöostase und Rekrutierung von Mastzellpopulationen gewähren. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Scholten, Julia julia.scholten@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-26524
Date:	2009
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Mastzellen , Mastzell-spezifische Cre-Expression , Cre-vermittelte Rekombination , Mastzell-Depletion in adulten Mäusen German Mast cells , mast cell-specific Cre expression , Cre-mediated recombination , mast cell ablation in adult mice English
Date of oral exam:	4 February 2009
Referee:	Name Academic Title Krieg, Thomas Prof. Dr. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2652