Universität zu Köln

Martins Boucas, Jorge Miguel (2008). Engineering AAV-2 Targeting Vectors: A New Insertion Site and scFv Driven Vectors. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF Boucas,_Jorge.pdf Download (13MB)

Abstract

Gene therapy can be defined as the introduction of nucleic acids into cells with the purpose of altering the course of a medical condition or disease. In many clinical settings, efficient and successful gene therapy relies on the delivery of genes to specific cells in the human body. Such specific delivery can only be achieved through the design of vehicles/vectors that are able to recognize the target cell - targeting. Adeno-associated virus type 2, a non-pathogenic human virus, has received an increased amount of attention as a vector for gene therapy since it was first cloned into a bacterial plasmid in 1982. Although the first attempt to construct an AAV-2 targeting vector made use of a single chain antibody fragment, it was the insertion of small peptide ligands into the AAV-2 capsid that marked the beginning of AAV-2 vector targeting. Sequence alignment of AAV-2 with CPV led to the discovery of amino acid position 587. Several reports have shown that small peptide ligands, once inserted in this position, are able to mediate transduction of the respective target cells, and that target specificity is retained in vivo. In this work, the available three dimensional structure of AAV-2 is used for the first time for the rational design and construction of targeting vectors. In silico analysis revealed that insertions at position 453 should result in a better exposure of the inserted peptides and, as a consequence, in a more efficient interaction with the target receptor. The RGD4C peptide - a ligand for aVb5 and aVb3 integrins - was inserted in position 453 and/or 587. Moreover, loss of AAV-2 wild-type (wt) tropism was achieved by R585A and R588A - A2 - mutations that abolish binding to the primary receptor - heparan sulfate proteoglycan, HSPG. ( ) NCBI's Conserved Domain Database was used to identify 453 homologues in other vector systems. In summary, 453 emerged as a suitable position for the insertion of targeting peptides in AAV-2 and other vector systems. Double insertion mutants will have to be analyzed for each specific case. The increased targeting efficiency after single point mutations of residues linearly distant from the inserted peptide shows for the first time how such mutations can indeed be relevant for the design of targeting mutants. Moreover, high-throughput selection protocols emerge as master tools and should be put into practice for the identification of similar mutants and for the optimization of targeting vectors. The rising number of reports on the high efficiency of antibody fragments for the construction of targeting molecules motivated the fusion of single chain antibody (scFv) fragments to the capsid of AAV-2. Being most likely too large for insertions in non-terminal positions like 453 or 587, we decided to genetically fuse a scFv to the N-terminus of a viral protein - VP. Furthermore, vectors containing a GFP-VP2 fusion protein have previously been shown to be useful tools for infectious biology studies. Our analysis of this GFP labeled vectors revealed that at least a part of the GFP molecule is present on the outer surface of the capsid. These observations led to generation of an anti-CD30 scFv fused to the N-terminus of a GFP molecule that was fused to the N-terminus of VP2. Optimization of the packaging procedure, by increasing the amount of the fusion protein encoding plasmid, resulted in an efficient packaging of scFv-AAV-2 mutants. Mutants were able to effectively transduce HeLa cells and to bind an anti-idiotypic antibody homologue to the recognized antigen epitope. Despite this, targeting mutants were not able to specifically transduce CD30 positive cells. Furthermore it was not possible to detect vector DNA with target cells neither 1 nor 4 hours post-transduction. Engineering similar constructs without the GFP molecule and with or without linker sequences did not result in an improved binding or transduction efficiencies. Substitution of the anti-CD30 scFv by an anti-CEA scFv or an anti-CA19 scFv revealed that the results observed with the anti-CD30 scFV targeting mutants were not idiotype specific. When compared to studies made with whole immunoglobulins, the low vector particle concentration emerges as one of the limiting steps to the application of such targeting approaches. Moreover, while each capsid possesses sixty repeats of G453, only five VP2 proteins exist per capsid. Despite this, the scFv-GFP-VP2 fusion represents the largest fusion (~127 kDa in total) ever assembled in an AAV capsid. This, together with the fact that both GFP and anti-CD30 scFv molecules could be recognized by respective antibodies reinforces the idea that the N-terminus of VP2 can indeed be displayed on the outer surface of the capsid. Our results open the door to many other therapeutic designs where the vector can be used as a carrier for genes and at the same time for high molecular weight proteins assembled in pentavalent forms.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Entwicklung von AAV2-Zielvektoren: Eine neue Insertions-Position und scFv AAV-Vektoren German
Translated abstract:	Abstract Language Die Gentherapie ist eine alternative Strategie zur Behandlung von Gendefekten und malignen Erkrankungen, die als therapeutisches Agens eine Nukleinsäure verwendet. Essentiell für den Erfolg vieler gentherapeutischer Ansätze ist ein effizienter und Zell-spezifischer Gentransfer. Hierzu werden Zell-spezifische Vektoren, sogenannte Targeting-Vektoren, benötigt. Für das in dieser Arbeit verwendete Vektorsystem, das auf dem nicht-pathogenen Serotyp 2 des Adeno-Assoziierten Virus (AAV-2) beruht, wird bevorzugt das direkte oder genetische targeting verwendet. Hierbei werden Peptidliganden in das AAV-Kapsid eingefügt, die dann die Interaktion mit dem gewünschten zellulären Rezeptor vermitteln. Als besonders geeignete für die Insertion und Präsentation von Peptidliganden hat sich hierbei die Aminosäureposition 587 (sowie die benachbarte Position, 588) erwiesen. In Ermangelung einer 3D-Struktur wurde zu ihrer Identifizierung ein Sequenz-Alignment mit einem verwandten Parvovirus, dem Canine Parvovirus (CPV) von dem entsprechende Strukturinformationen vorlagen, durchgeführt. ( )Zusätzlich wurde mit Hilfe der NCBI Concerved domain database zu 453 im AAV-2 Kapsid homologe Positionen in anderen Parvoviren identifiziert, um die Anwendungsmöglichkeiten der in dieser Arbeit identifizierten und optimierten Insertionsstelle zu erweitern. Somit konnte in diesem Teil der Arbeit gezeigt werden, dass sich die Aminosäureposition 453 zur Insertion von Tropismus-modulierenden Peptidliganden eignet. Doppelinsertionsmutanten (Peptidliganden in Position 453 und 587) können ebenfalls generiert werden. Ihre Infektionsfähigkeit scheint jedoch peptidabhängig zu sein. Ein weiterer interessanter Befund ist die deutliche Verbesserung der Rezeptorbindungsfähigkeit durch Kombination von RGD4C-Insertion und A2-Mutation. Dies stellt das erste Beispiel für die Bedeutung von Punktmutationen zur Optimierung von Targeting-Vektoren dar. Auf diesem Hintergrund wird die Wichtigkeit von evolutionären Ansätzen und high throughput-Selektionen für die Vektorentwicklung noch einmal deutlich. In diesen Ansätzen werden aus Bibliotheken von Kapsidmutanten für die jeweilige Anwendung optimierte Mutanten selektioniert. Die sich mehrenden Berichte über die hohe Spezifität von Antikörperfragmente (single-chain Antikörper; scFv) motivierte das zweite Projekt dieser Arbeit. Da scFv aufgrund ihrer Größe ungeeignet für eine Insertion innerhalb von AAV-Kapsidproteinen z.B. an Position 453 oder 587 sind, wurde in dieser Arbeit der Versuch unternommen, Fusionsproteine zwischen scFv und dem N-Terminus von VP2 (zweitgrößtes AAV-Kapsidprotein) in das Kapsid von AAV einzubauen. Da wir vor kurzem zeigen konnten, dass Fusionsproteine aus GFP und VP2 in das Kapsid eingebaut werden, dass das GFP auf der Kapsidoberfläche exponiert wird, und dass GFP-markierte Viren infektiös sind, wurde zunächst ein Fusionsprotein aus anti-CD30 scFv-GFP-VP2 hergestellt. Diverse Optimierungen des Verpackungsprotokolls waren nötig, um anti-CD30 scFv-GFP-VP2 enthaltende Vektorpartikel zu generieren. Diese Mutanten konnten HeLa-Zellen transduzieren und interagierten mit einem anti-idiotypischen Antikörper. Es konnte jedoch keine spezifische Transduktion von CD30-positiven Zellen nachgewiesen werden. Außerdem konnte weder nach einer noch nach vierstündiger Inkubation der Zellen mit Vektorlösung Vektor-DNA in oder an Zellen nachgewiesen werden. Weder die Eliminierung des GFP-Anteils noch das Einbringen von linker-Sequenzen führte zu einer Verbesserung der Bindungs- oder Transduktionseffizienz. Der Austausch des anti-CD30 scFv gegen ein anti-CEA scFv und ein anti-CA19 scFv führte zu denselben Ergebnissen, woraus geschlossen werden kann, dass die mit anti-CD30 scFV erhaltenen Ergebnisse nicht spezifisch für den anti-CD30 scFv sind. Vergleicht man Studien, die vollständige Immunglobuline verwenden, mit dieser Studie, so könnte die geringe Vektorpartikelkonzentration einen limitierten Faktoren darstellen. Zudem finden sich pro AAV-Kapsid nur 5 VP2-Proteine, d.h. es können maximal 5 VP2-Fusionsproteine eingebaut werden. Dies ist deutlich weniger als bei Targeting-Vektoren, die einen Ligand z.B. in Position 453 inseriert enthalten. Hier wird der Ligand in alle 60 Kapsidproteinen eingebaut und steht so deutlich häufiger für eine Rezeptorbindung zur Verfügung. Trotzdem darf festgehalten werden, dass durch die hier durchgeführte Arbeit, das bisher größte Fusionsprotein (~ 127 kDa) in das AAV-Kapsid eingebaut werden konnte. Diese Tatsache zusammen mit der Beobachtung, dass sich sowohl das GFP als auch der anti-CD30 scFv auf der Kapsidoberfläche befinden, eröffnet viele neue Möglichkeiten der Anwendung. So könnte AAV-2 gleichzeitig als Proteincarrier (Fusion mit dem N-Terminus) und als Gencarrier (Transgen) fungieren. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Martins Boucas, Jorge Miguel mail@jorgeboucas.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-26901
Date:	2008
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language AAV, Gentransfer German AAV, Gene transfer English
Date of oral exam:	27 October 2008
Referee:	Name Academic Title Pasparakis, Manolis Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2690