Proteolytische Kontrolle des Proteins der promyelozytischen Leukämie (PML) durch Modifikation mit dem Ubiquitin-verwandten Protein SUMO

Weißhaar, Stefan Rene (2008). Proteolytische Kontrolle des Proteins der promyelozytischen Leukämie (PML) durch Modifikation mit dem Ubiquitin-verwandten Protein SUMO. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Das Ubiquitin-verwandte Protein SUMO (small ubiquitin like modifier) wird kovalent an viele verschiedene Zielproteine gebunden, darunter auch an das promyelozytische Leukämie (PML) Protein. Die Protein-Modifizierung mit SUMO ist ein wichtiger regulatorischer Mechanismus, der an vielen zellulären Prozessen beteiligt ist, viele davon auch mit biomedizinischer Relevanz. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde die Inhibition des Proteasoms und die daraus resultierende Akkumulation von Proteinen in humanen Zellen untersucht, die gleichzeitig mit SUMO und Ubiquitin konjugiert sind. Vorangegangene Studien charakterisierten einen Signalweg in der Hefe Saccharomyces cerevisiae der den proteolytischen Abbau von SUMOylierten Proteinen mittels spezifischer Ubiquitin-Ligasen für SUMO-Konjugate (ULS) koordiniert. Die vorliegende Arbeit erbringt den ersten Beweis, dass die Verbindung zwischen dem SUMO- und dem Ubiquitin-Signalweg für den Abbau über das 26S Proteasom von der Hefe bis zum Menschen konserviert vorzufinden ist. Die Ergebnisse implizieren, dass diese proteolytische Kontrolle spezifisch durch Konjugate mit kettenbildenden SUMO2/3-Isomeren vermittelt wird. Arsentrioxid (ATO) ist ein hochwirksames Medikament in der klinischen Behandlung der akuten promyelozytischen Leukämie (APL), die durch das onkogene PML-RAR alpha-Fusionsprotein hervorgerufen wird. Das PML-RAR alpha-Fusionsprotein besteht aus dem N-terminalen Bereich des PML-Proteins und der C-terminalen Region des Retinsäure Rezeptors alpha (RAR alpha). Die Behandlung mit ATO führt zum Abbau des PML-RAR alpha-Fusionproteins, zur Differenzierung der Leukämie-Zellen und zur vollständigen Heilung. Dabei ist der zugrunde liegende Mechanismus dieses Abbaus bisher noch nicht entschlüsselt worden. Hier wird die ATO-induzierte SUMO2/3-Modifikation und die anschließende Ubiquitinierung von PML beschrieben. Damit konnte PML als das erste spezifische Substrat des ULS-vermittelten Abbaus identifiziert werden. Zusätzlich konnten wir RNF4 als das spezifische ULS-Protein für SUMO-modifiziertes PML identifizieren. Des Weiteren wird in dieser Studie die Etablierung eines in vitro und eines in vivo SUMOylierungsystems beschrieben. Beide Systeme ermöglichen die unkomplizierte Herstellung von SUMOylierten Substraten, was am Beispiel für PML gezeigt wird. Dieses kann in der Folge für biochemische Studien bezüglich des Einflusses der posttranslationalen SUMO-Modifikation eingesetzt werden.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Proteolytic control of promyelocytic leukemia protein (PML) mediated by modification with ubiquitin related modifier SUMO	English

Translated abstract:

Abstract

Language

The small ubiquitin-related modifier (SUMO) is covalently attached to many different target proteins, including the promyelocytic leukaemia (PML) protein. The SUMO modification of proteins is an important regulatory mechanism implicated in many cellular processes, including several of biomedical relevance. In the present thesis the inhibition of the proteasome and resulting accumulation of proteins that are simultaneously conjugated to both SUMO and ubiquitin have been studied in human cells. Previous studies had recognised a pathway that mediates the proteolytic down-regulation of sumoylated proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae and that involves the action of specific ubiquitin ligases for SUMO conjugates (ULS). This present work provides first evidence that this connection between SUMO and the ubiquitin pathway to target substrates for the degradation via the 26S proteasome is conserved from yeast to human. The results indicate that in particular conjugates formed by the chain forming SUMO2/3 isoforms are subject to this proteolytic control in human cells. Arsenic trioxide (ATO) is a powerful drug in the clinical treatment of acute promyelocytic leukaemia (APL) which is caused by the oncogenic PML-RAR alpha fusion protein consisting of the N-terminal region of the PML protein and the C-terminal region of the retinoic acid receptor alpha (RAR alpha). ATO treatment induces the degradation of the PML-RAR alpha fusion protein, differentiation of leukaemic cells and clinical remission. However, the underlying mechanism of this degradation pathway has remained elusive. Here it is shown that ATO induces the SUMO2/3 modification and subsequent ubiquitylation of PML. Therefore PML is the first described human protein degraded by the ULS pathway and we were able to identify RNF4 as the ULS protein modifying SUMOylated PML with ubiquitin. Additionally, the establishment of an in vitro and an in vivo SUMOylation system is reported in this study. Both systems are powerful tools to generate SUMOylated proteins, shown with PML constructs, in order to investigate further biochemical properties of the SUMO-modification in several aspects.

English

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