Universität zu Köln

Töpffer, Stephanie (2008). Charakterisierung der Interaktion der E6-Onkoproteine humaner Papillomviren mit der Protein-Tyrosin-Phosphatase H1 (PTPH1). PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Zusammenfassung Das E6-Protein des mit dem Zervixkarzinom assoziierten Humanen Papillomavirus (HPV) 16 (16E6) besitzt ein C-terminales PDZ-Bindemotiv, das unter den E6-Proteinen genitaler Hoch-Risiko-HPV-Typen konserviert ist. Über dieses PDZ-Bindemotiv bindet E6 an PDZ-Domänen-haltige Proteine und induziert in der Regel deren proteasomale Degradation. Dies korreliert mit dem onkogenen Potential von 16E6. Im Rahmen der Vorarbeiten wurde eine Interaktion der Protein-Tyrosin-Phosphatase PTPH1 mit dem PDZ-Bindemotiv von 16E6 beobachtet. PTPH1 besitzt Eigenschaften eines Tumorsuppressorproteins. In dieser Arbeit konnte die Interaktion zwischen 16E6 und PTPH1 mittels GST-Pull-Down Experimenten und Ko-Immunopräzipitationen bestätigt werden. In vitro und in vivo Degradationsassays belegten, dass 16E6 den proteasomalen Abbau von PTPH1 induziert. Hierfür waren sowohl die Interaktion des PDZ-Bindemotivs von 16E6 mit der PDZ-Domäne von PTPH1 als auch die Bindung von 16E6 an die zelluläre Ubiquitin-Ligase E6-AP notwendig. Die Wechselwirkung mit PTPH1 scheint unter den genitalen Hoch-Risiko E6-Proteinen konserviert zu sein, da auch HPV18 E6 an PTPH1 bindet und dessen Degradation vermittelt. HPV-positive, von Zervixkarzinomen abstammende Zelllinien, wiesen geringere Spiegel an endogenem PTPH1 auf, als HPV-negative Zellen, was darauf hindeutet, dass das in diesen Zelllinien exprimierte E6 intrazelluläres PTPH1 degradiert. Entsprechend kam es nach Einführen des HPV16 E2-Proteins, das die Expression von E6 stark reprimiert, in HPV16 positiven SiHa-Zellen zur Erhöhung der endogenen PTPH1-Mengen. Die Degradation von PTPH1 scheint auch für die morphologische Transformation von etablierten Nagerzelllinien durch 16E6 essentiell zu sein. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Reduktion des endogenen PTPH1 durch spezifische shRNA zur morphologischen Transformation der C127i-Mausfibroblasten-Zelllinie führte. Mittels eines Substrat-Trapping-Assays konnten drei potentielle Substrate von PTPH1 identifiziert werden. Zwei davon, Plectin-1 und β-Aktin, spielen eine Rolle bei der Ausbildung des Zytoskeletts. E6-Proteine kutaner Hoch-Risiko HPV-Typen haben ebenfalls onkogenes Potential. So induziert auch das E6-Protein des kutanen HPV8 (8E6) die morphologische Transformation von C127i-Zellen. Obwohl 8E6 kein PDZ-Bindemotiv besitzt, konnte hier eine Interaktion mit PTPH1 festgestellt werden. Die Auswirkung der Interaktion mit 8E6 auf die Funktion von PTPH1 bleibt allerdings offen. 8E6 führte weder zum verstärkten Abbau von PTPH1, noch hatte es einen Einfluss auf die Phosphataseaktivität. 8E6 bindet über seine N-terminale Domäne an PTPH1. Die Mutation des Valins an Position 68, das unter den E6 Proteinen kutaner HPV-Typen konserviert ist, in ein Prolin, das sich an der entsprechenden Position bei genitalen E6 Proteinen befindet, eliminierte weitgehend die Interaktion mit PTPH1. Darüber hinaus verlieh das Prolin an Position 68 8E6 die Fähigkeit, Wachstum von RTS3b-Zellen im Wachstumsfaktor reduzierten Medium zu induzieren. Das Wildtyp 8E6 war dazu nicht in der Lage, im Gegensatz zu 16E6. Entsprechend führte der Austausch des Prolins an Position 59 in 16E6 in ein Valin dazu, dass RTS3b-Zellen im reduzierten Medium nicht wachsen konnten. Diese Daten deuten daraufhin, dass die Aminosäure Valin an Position 68 bei kutanen E6-Proteinen die Interaktion mit PTPH1 vermittelt, während die genitalen Hoch-Risiko E6 Proteine PTPH1 über ihr PDZ-Bindemotiv binden. Das Prolin an entsprechender Position genitaler E6-Proteine hingegen verleiht die Fähigkeit, die Wachstumsfaktor-Abhängigkeit der Zielzellen zu verringern, eine Eigenschaft, die den kutanen E6-Proteinen fehlt.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Characterisation of the interaction of E6-oncoproteins from human papillomaviruses with the protein-tyrosine-phosphatase H1 (PTPH1) English
Translated abstract:	Abstract Language Abstract The E6 protein of the cervical carcinoma associated human papillomavirus (HPV) 16 (16E6) has a C-terminal PDZ-binding-motif, which is conserved among genital high-risk HPV-types. Via this motif E6 can bind to PDZ-domain proteins and induce their accelerated degradation. This contributes to the oncogenic potential of 16E6. The protein-tyrosine-phosphatase PTPH1 was identified as a new protein bound by the PDZ-binding-motif of 16E6. PTPH1 was suggested to act as a tumor-suppressor-protein. In this work the interaction between 16E6 and PTPH1 was confirmed by GST-pull-down-assays and co-immunoprecipitations. In vitro and in vivo degradation-assays revealed, that 16E6 induced the proteosomal degradation of PTPH1. This required both the interaction of the PDZ-binding-motif with the PDZ-domain of PTPH1 and the binding of 16E6 to the cellular ubiquitin ligase E6-AP. The targeting of PTPH1 seems to be conserved among high-risk genital E6 proteins, since also HPV18 E6 was able to interact with PTPH1 and to mediate its accelerated degradation. HPV-positive cervical carcinoma cell lines revealed lower levels of endogenous PTPH1 than HPV negative cells. This suggests that the expression of E6 in these cells enhances the degradation of intracellular PTPH1. Correspondingly the introduction of the HPV16 E2 protein, known to repress the expression of E6 resulted in higher amounts of PTPH1 in HPV16 positive SiHa-cells The interaction with PTPH1 may be essentiell for the 16E6-mediated morphologic transformation of established rodent cell lines. Here it has been shown, that the reduction of endogenous PTPH1 by specific shRNA induced the morphological transformation of the C127i-mouse fibroblast cell line. Three potential substrates of PTPH1 have been identified by substrate-trapping-assays. Two of them are invoveld in the developement of the cytoskelet. E6 proteins of cutaneous high-risk HPV-types also have oncogenic potential. For instance the E6 protein of the cutaneous HPV8 (8E6) has the ability to transform C127i-cells as well. Although 8E6 does not encode a PDZ-binding-motif, an interaction with PTPH1 was observed. The consequence of this interaction on the function of PTPH1 remains unclear. 8E6 neither affected the stability of PTPH1, nor the phosphatase activity. 8E6 binds to PTPH1 via its N-terminal domain. The mutation of the valin at position 68, which is conserved among the cutaneous E6 proteins, to prolin, the conserved amino acid at the corresponding position in the E6 proteins of genital high-risk HPV-types, eliminated the interaction with PTPH1. Moreover the prolin in position 68 enabled 8E6 to induce cell growth in growth factor reduced medium. This activity could not be observed with wildtype 8E6, in contrast to 16E6. Correspondingly, the replacement of the prolin at position 59 in 16E6 by valin did not allow the growth of cells expressing this 16E6 mutant in reduced media. These data implicate, that the amino acid at position 68 of cutaneous E6 proteins mediates the interaction with PTPH1, while genital high-risk E6 proteins bind to PTPH1 via their PDZ-binding-motif. A prolin at the corresponding position in genital E6 proteins confers their ability to reduce growth factor requirements of target cells. This feature is not shared by cutaneous E6 proteins. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Töpffer, Stephanie steffi.toepffer@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-26923
Date:	2008
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Virologie > Institut für Virologie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language HPV16 , HPV8 , PTPH1 , E6-Proteins German HPV16 , HPV8 , PTPH1 , E6-Proteins English
Date of oral exam:	25 November 2008
Referee:	Name Academic Title Pfister, Herbert Prof. Dr. Dr. h.c.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2692