Universität zu Köln

Fittinghoff, Kirsten (2008). Functional Analysis of the SPA Gene Family in Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Ambient light conditions affect development throughout the plant life cycle, including seed germination, seedling development and the induction of flowering. In the model plant Arabidopsis, the COP1-SPA ubiquitin ligase complex plays a central role in suppressing light signaling in darkness. The COP1-SPA complex targets positively acting factors like HY5, a protein necessary for normal seedling development in the light, several photoreceptors and the flowering time regulator CONSTANS for degradation via the 26S proteasome. Therefore, one of the major functions of the light signal transduction pathways is the inactivation of the COP1-SPA complex. While COP1 is a single copy gene, the SPA proteins are encoded by four different loci (SPA1-SPA4). All SPA proteins have redundant, but also distinct functions in regulating plant development. SPA1 and SPA2 are the key regulators that suppress photomorphogenesis in dark-grown seedlings. Over-stimulation in light-grown seedlings is primarily prevented by SPA1, and to a minor extent, also by SPA3 and SPA4. SPA2, in contrast has only negligible function in the light. SPA1 is sufficient for repressing flowering under non-inductive short-day conditions. Here, I show that distinct functions of the SPA genes partially correlate with their distinct gene expression patterns. RNA gel blot-analysis revealed that the expression of SPA1, SPA3 and SPA4, but not that of SPA2, is positively influenced by light of different wavelengths. All main photoreceptors contribute to the up-regulation of these SPA transcripts, implying that photoreceptors initiate a negative feedback regulation, which might protect plants from over-stimulation by light. GUS reporter gene experiments show that SPA genes exhibit somewhat distinct tissue-specific expression patterns, which might be important for tissue specific regulation of COP1-SPA targets. However, differences in SPA gene expression cannot account for all distinct SPA gene functions. Promoter-swap experiments with SPA1, SPA2 and SPA4 show that all SPA proteins are potent repressors in dark-grown seedlings. SPA1 and SPA4 also act as repressor in the light. SPA2, however, can never act as a repressor in the light, not even when it is expressed from the strong light-induced SPA1 promoter. These results show that SPA proteins themselves feature properties that determine characteristic SPA protein functions. All SPA proteins feature a characteristic domain structure with a C-terminal WD-repeat, a central coiled-coil domain and a less well-conserved N-terminus that includes a kinase-like motif. The WD-repeat domain and the coiled-coil domain are essential for formation of the COP1-SPA complex as well as interactions with various ubiquitination targets. In contrast, the function of the N-terminal domain is unknown. Aiming to determine the importance of the N-terminal domain of SPA1, I conducted a structure-function analysis. While the N-terminal domain of SPA1 is dispensable for SPA1 function in the seedling stage, this domain is required for SPA1-mediated repression of flowering in non-inductive short-day conditions. These results indicate, that the SPA1 N-terminal domain can full-fill an essential function.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Funktionale Analyse der SPA Genfamilie in Arabidopsis thaliana German
Translated abstract:	Abstract Language Viele Abschnitte im Lebenszyklus von Pflanzen, wie z.B. die Samenkeimung, die frühe Keimlingsentwicklung (De-etiolierung) oder die Induktion der Blütenbildung, werden maßgeblich durch das Sonnenlicht beeinflußt. Dabei spielt der Arabidopsis COP1-SPA Proteinkomplex eine zentrale Rolle, denn er verhindert eine Lichtantwort im Dunkeln. Der COP1-SPA-Komplex ist vor allem in Dunkelheit aktiv und verantwortlich für die Ubiquitin-vermittelte Degradation von positiv wirkenden Faktoren der Lichtsignaltransduktion, wie den Transkriptionsfaktoren HY5, der die Keimlingsentwicklung steuert, oder CONSTANS, der die Blütenbildung fördert. Im Licht wird die Funktion des COP1-SPA Komplexes gedrosselt, eine Aufgabe, die von mehreren Photorezeptoren bewerkstelligt wird. Das COP1 Protein wird in Arabidopsis von einem einzigen Locus kodiert, während die SPA Proteine von einer Genfamilie bestehend aus vier Mitgliedern kodiert werden (SPA1-SPA4). SPA Gene haben überlappende, jedoch auch distinkte Funktionen im Lebenszyklus von Arabidopsis. SPA1 und SPA2 sind hauptverantwortlich für die Unterdrückung der Photomorphogenese im Dunkeln. SPA2 hat keine Funktion bei der lichtgesteuerten Keimlingsentwicklung, die hingegen hauptsächlich von SPA1 und in geringerem Maße auch von SPA3 und SPA4 reguliert wird. SPA1 ist zudem ausreichend, um eine verfrühte Blütenbildung im Kurztag zu verhindern. Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Grundlagen der unterschiedlichen Funktionen der SPA Gene zu verstehen. Unterschiedliche SPA Gen-Funktionen lassen sich teilweise auf eine unterschiedliche SPA Genexpression zurückführen. RNA-Blot-Experimente zeigen, dass die mRNA-Mengen von SPA1, SPA3 und SPA4, nicht aber die von SPA2, positiv durch Licht beeinflußt werden. Mehrere Photorezeptoren wirken dabei zusammen, um die Expression der SPA Gene im Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu fördern. SPA-Promotor-Reportergen Analysen zeigen zudem eine zum Teil differentielle Expression der SPA-Gene während der Pflanzenentwicklung. Jedoch kann die unterschiedliche Expression der SPA-Gene nicht alle distinkten Funktionen der SPA Proteine erklären. Promoter-Austausch-Experimente mit den regulatorischen Elementen und cDNAs von SPA1, SPA2 und SPA4 zeigen, dass alle SPA Proteine im Dunkeln wirken können. SPA1 und SPA4 Proteine können außerdem im Licht als Repressoren fungieren, hingegen kann das SPA2-Protein nicht im Licht wirken, selbst wenn die SPA2-cDNA unter der Kontrolle des licht-induzierten SPA1-Promotors steht. Diese Resultate zeigen, dass Unterschiede in der SPA Proteinsequenz ebenfalls einen Einfluß auf deren Funktionen haben. Alle SPA Proteine zeigen eine ähnliche Domänen-Anordnung. Im stark konservierten carboxy-terminalen Bereich der SPA Proteine befindet sich eine WD-40 Repeat-Domäne, die ebenso wie die zentrale Coiled-Coil Domäne der SPA Proteine Interaktionen mit anderen Poteinen vermittelt. Die amino-terminale Region (N-Terminus) ist innerhalb der SPA Proteine weniger stark konserviert, zeigt aber in jedem der SPA Proteine eine schwache Ähnlichkeit mit einem Ser/Thr-Kinase-motiv. Um die Funktion dieser schwach konservierten Region näher zu untersuchen, wurde eine SPA1-Struktur-Funktionsanalyse durchgeführt. Interessanterweise ist ein SPA1 Protein ohne N-Terminus in der Lage, seine Rolle in der Keimlingsentwicklung vollständig auszufüllen. Hingegen ist es unfähig, die verfrühte Induktion der Blütenbildung im Kurztag zu hemmen. Daher zeigen diese Ergebnisse, dass der N-Terminus der SPA Proteine eine essentielle Rolle spielen kann. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Fittinghoff, Kirsten kirsten.fittinghoff@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-27083
Date:	2008
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language SPA , Lichtsignaltransduktion , Proteindegradation , Arabidopsis German SPA , light signal transduction , protein degradation , Arabidopsis English
Date of oral exam:	1 February 2009
Referee:	Name Academic Title Höcker, Ute Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2708