Struktur und Funktionsmechanismus der mitochondrialen m-AAA-Protease aus S. cerevisiae

Augustin, Steffen (2008). Struktur und Funktionsmechanismus der mitochondrialen m-AAA-Protease aus S. cerevisiae. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

ATP-abhängige Proteasen (AAA+ Proteasen) nutzen die Energie aus der ATP-Hydrolyse, um Substratproteine zu entfalten und in eine proteolytische Kammer zu translozieren, in der der Abbau zu Peptiden erfolgen kann. In der mitochondrialen Innenmembran der Hefe S. cerevisiae sind zwei konservierte ATP-abhängige Proteasen lokalisiert, die homo-oligomere i-AAA-Protease und die hetero-oligomere m-AAA-Protease; letztere ist aus Yta10- und Yta12-Untereinheiten aufgebaut. Weder der katalytische Mechanismus der Untereinheiten noch ihre Stöchiometrie und Anordnung im m-AAA-Proteasekomplex waren zu Beginn dieser Arbeit bekannt. Durch elektronenmikroskopische Analyse gelang es, die Struktur der m-AAA-Protease darzustellen. Dabei zeigte sich, dass die Protease ein Hexamer ist. Biochemische und genetische Daten deuten darauf hin, dass Yta10 und Yta12 im hexameren Komplex alternierend angeordnet sind. Eine umfassende Analyse von m-AAA-Proteasevarianten mit Mutationen in den ATPase-Domänen ermöglichte es, den ATP-Hydrolysezyklus und seine Bedeutung für die Substrattranslokation aufzuklären. Die m-AAA-Protease hydrolysiert ATP entsprechend einem semi-sequenziellen Mechanismus und gewährleistet dadurch die Substratprozessierung. Die Regulation des ATP-Hydrolysezyklus erfolgt durch ATP-Bindung an Yta12. Vermutlich wird die ATP-Hydrolyse weiterer hetero- und homo-oligomerer AAA+-Proteine durch die Bindung von ATP reguliert und erfolgt entsprechend semi-sequenzieller oder sequenzieller Mechanismen, um eine effiziente Substratprozessierung zu ermöglichen. Um die Wirkungsweise der m-AAA-Protease bei der Prozessierung von Substraten eingehender zu untersuchen, wurde die Reifung der Cytochrom-c-Peroxidase (Ccp1) analysiert. Es konnte zum ersten Mal eine nicht-proteolytische Funktion der m-AAA-Protease nachgewiesen werden: Die m-AAA-Protease disloziert Ccp1 unter Energieverbrauch aus der mitochondrialen Innenmembran und ermöglicht dadurch die Prozessierung des Proteins durch die Rhomboid-Protease Pcp1. Ccp1 wird dabei wahrscheinlich durch die zentrale Pore der m-AAA-Protease transloziert. Beim durch die m- und i-AAA-Protease vermittelten Proteinabbau entstehende Peptide werden aus dem Organell exportiert. Die Zusammensetzung freigesetzter Peptide wurde analysiert. Ein heterogenes Peptidgemisch, das Proteolyseprodukte aller ATP-abhängigen mitochondrialen Proteasen enthielt, konnte nachgewiesen werden. Peptide von Atmungskettenkomponenten waren überrepräsentiert, was für einen verstärkten Umsatz dieser Proteine spricht. Zusätzlich konnte eine Beteiligung der Oligopeptidasen Prd1 und Mop112 beim Abbau exportierter Peptide nachgewiesen werden. Diese Befunde ermöglichen ein generelles Verständnis der Funktionsprinzipien von AAA+-Proteinen und geben Einblick in die Stabilität des mitochondrialen Proteoms.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Structural and functional characterisation of the mitochondrial m-AAA protease from S. cerevisiae	English

Translated abstract:

Abstract

Language

ATP-dependent proteases (AAA+ proteases) use the energy derived from ATP hydrolysis to unfold and translocate substrates into a proteolytic chamber, in which degradation to peptides can occur. In the mitochondrial inner membrane of S. cerevisiae two conserved ATP-dependent proteases are localised: i- and m-AAA proteases. Whereas the i-AAA protease is a homo-oligomer, the m-AAA protease is a hetero-oligomeric complex composed of highly homologous Yta10 and Yta12 subunits. Despite considerable progress in understanding the activities of the m-AAA protease within mitochondria neither the catalytic mechanism of the subunits nor their number and arrangement within the hetero-oligomeric complex have previously been defined. Structural analysis of purified m-AAA protease complexes by electron microscopy revealed that the m-AAA protease is a hexamer. Biochemical and genetic data suggest that Yta10 and Yta12 are arranged alternatingly within the complex. A comprehensive analysis of m-AAA protease variants harbouring mutations in the ATPase domains allowed to decipher the ATP hydrolysis cycle and its significance for the translocation of substrates: the m-AAA protease hydrolyses ATP in a semi-sequential manner and thereby guarantees the processing of substrates. The ATP hydrolysis cycle is regulated by binding of ATP to Yta12. Presumably, ATP hydrolysis in other hetero- and homo-oligomeric AAA+ proteins is also regulated by binding of ATP and accordingly works in a semi-sequential or sequential manner to allow efficient substrate processing. To unravel the mechanism of the m-AAA protease in substrate processing more precisely, the maturation of cytochrome c peroxidase (Ccp1) was analysed. For the very first time a non-proteolytic function of the m-AAA protease was identified: the m-AAA protease dislocates Ccp1 in an ATP-dependent manner from the inner membrane to allow processing of the protein by the rhomboid protease Pcp1. In this process, Ccp1 is presumably translocated through the central pore of the m-AAA protease. Protein degradation by the m- and the i-AAA protease leads to the generation of peptides that are exported from the organelle. The composition of released mitochondrial peptides was analysed by mass spectrometry. A heterogeneous mixture of peptides generated by the activity of all ATP-dependent mitochondrial proteases could be identified. Interestingly, peptides derived from respiratory chain subunits were overrepresented, which argues for an enhanced turnover of these proteins. Additionally, the involvement of the oligopeptidases Prd1 and Mop112 in degradation of peptides exported from mitochondria could be demonstrated. Taken together, these findings provide a general understanding of how AAA+ proteins function and allow gaining insight into the stability of the mitochondrial proteome.

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