Universität zu Köln

Höppner, Astrid (2008). Enzym-Substratkomplexe der Quinat-Dehydrogenase aus Corynebacterium glutamicum. Strukturen, Katalyse und Spezifitäten. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Quinat-Dehydrogenase aus Corynebacterium glutamicum (CglQDH) enzymkinetisch charakterisiert und ihre Struktur in verschiedenen funktionellen Zuständen röntgenkristallographisch untersucht. Die CglQDH gehört zu den NAD(H)-abhängigen Oxidoreduktasen. Sie ist im katabolen Quinat-Stoffwechsel lokalisiert und spielt eine wichtige Rolle bei der xenobiotischen Detoxifikation sowie beim Ligninabbau. Die Quinat-Dehydrogenase katalysiert die NAD(P)-abhängige Oxidation von Quinat zu 3-Dehydroquinat über einen Hydridionen-Transfer, sowie die entsprechende Rückreaktion. Durch die Ergebnisse der enzymkinetischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Quinat-Dehydrogenase sowohl unter optimalen pH-Bedingungen, als auch unter physiologischem pH eine deutlich höhere Affinität und katalytische Effizienz gegenüber Quinat verglichen mit Shikimat besitzt. Des Weiteren ist sie strikt NAD-abhängig, NADP kann nicht umgesetzt werden. Die CglQDH konnte darüber hinaus im binären Komplex mit NAD und in zwei verschiedenen ternären Komplexen (Quinat und NADH bzw. Shikimat und NADH) kristallisiert und mit einer hohen Auflösung aufgeklärt werden (1,0 A bzw. 1,16 A). Diese Strukturinformationen ermöglichen erstmalig Aussagen zur Substrat- und Cofaktor-Bindung bzw. -Diskriminierung sowie dem möglichen Katalysemechanismus bei einer Quinat-Dehydrogenase. Im Vergleich zur Apostruktur der CglQDH (2nlo, Dissertation Jan Schoepe) zeigen die Domänen der Quinat-Dehydrogenase nach der Substrat- und Cofaktor-Bindung eine offene Konformation. Durch den Vergleich der Aminosäurezusammensetzung und der Architektur des aktiven Zentrums der CglQDH mit eng verwandten Enzymen kann sowohl die strikte NAD-Abhängigkeit, als auch der schlechtere Shikimat-Umsatz dieses Enzyms erklärt werden. Alle Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bekräftigen den für den Hydridtransfer postulierten Reaktionsmechanismus der katalytischen Dyade, bei der ein Lysin als Protonenakzeptor agiert, während ein benachbartes Aspartat diesen Protonenabzug vom Substrat und den anschließenden Hydridionen-Transfer auf den Cofaktor erleichtert.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Enzyme substrate complexes of the quinate dehydrogenase of Corynebacterium glutamicum � structures, catalysis and specificities English
Translated abstract:	Abstract Language The quinate dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum (CglQDH) was kinetically characterized and its structure was determined by x-ray crystallographic analysis in three different functional states. CglQDH belongs to the NAD(H) dependent oxidoreductases, which is localized in the catabolic quinate metabolism. It plays an important role for xenobiotic detoxification as well as for the degradation of lignin. Quinate dehydrogenase catalyzes the NAD(P) dependent oxidation of quinic acid to 3-dehydroquinic acid by the transfer of a hydride, as well as its reverse. The results of the kinetic measurements exhibit a clearly higher affinity and catalytical efficiency of the CglQDH relating to quinate compared to Shikimate, not only under optimal pH conditions but also at physiological pH. Furthermore the QDH is strictly NAD dependent, it is unable to convert NADP. In addition we have determined several crystal structures of CglQDH with a maximum resolution of 1.0 A or 1.16 A, including its binary complex with cofactor NAD and two different ternary complexes with both its substrate quinate and cofactor NADH or shikimate and NADH, respectively. These structure based information enable first insights into substrate and cofactor binding and discrimination as well as into the likely catalytic mechanism of a quinate dehydrogenase. Compared to the structure of the CglQDH apoenzyme (2nlo, PhD thesis Jan Schoepe, 2006) the quinate dehydrogenase domains exhibit an open conformation after substrate and cofactor binding. By analysis of both the amino acid composition and architecture of the CglQDH active side and those of closely related enzymes we were able to explain the strict NAD dependence as well as the poorer shikimate turnover of this enzyme. All results presented here confirm the postulated reaction mechanism of hydride transfer by a catalytic dyad, in which a lysine acts as a proton acceptor, while a neighbouring aspartate facilitate both proton abstraction of the substrate and subsequent hydride transfer to the cofactor. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Höppner, Astrid astrid.hoeppner@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-27434
Date:	2008
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Quinat-Dehydrogenase , Enzym-Substrat-Komplexe , Kristallstrukturen , Kinetik German quinate dehydrogenase , enzyme substrate complexes , crystal structures , enzyme kinetics English
Date of oral exam:	25 June 2008
Referee:	Name Academic Title Schomburg, Dietmar Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2743