Universität zu Köln

Baschuk, Nikola (2009). Immune Surveillance of Cancer - Molecular and Translational Aspects of Cytotoxic Effector : Target Cell Interactions. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF Doktorarbeit_Veroeffentlichung.pdf Download (1MB)

Abstract

Effects of IL-4 and IL-10 on CD8+ CTL in a tumor antigen-specific immune response Sustained control or even eradication of tumors by immunotherapy requires durable and highly effective tumor-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL). In this report we analyzed the impact of interleukin-4 (IL-4) and interleukin-10 (IL-10) on tumor-associated simian virus 40 (SV40) large T-antigen (TAg)-specific CD8+ cytotoxic T cells during rejection of syngeneic SV40 transformed mKSA tumor cells in BALB/c mice. Strikingly, challenge of naïve mice with low doses of mKSA tumor cells revealed a CD8+ T cell-dependent prolonged survival time of naïve IL-4-/- mice. In mice immunized with SV40 TAg we observed in IL-4-/- mice, or in wild type mice treated with neutralizing anti-IL-4 monoclonal antibody, a strongly enhanced TAg-specific cytotoxicity of tumor associated CD8+ T cells. The enhanced cytotoxicity in IL-4-/- mice was accompanied by a significant increase in the fraction of CD8+ tumor associated T-cells expressing the cytotoxic effector molecules granzyme A and B and in granzyme B-specific enzymatic activity. The data suggest that endogenous IL-4 can suppress the generation of CD8+ CTL expressing cytotoxic effector molecules especially when the antigen induces only a very weak CTL response. In IL-10-deficient mice we here describe a previously unrecognized population of tumorantigen-specific cytotoxic intraepithelial lymphocytes (IEL) whose anti-tumoral effectivity by far exceeds that of conventional CD8+ CTL. TAg-immune IL-10-/- BALB/c mice reject intraperitoneal TAg-expressing mKSA tumor cells more rapidly than wt mice. TAg-specific conventional CD8+ CTL became detectable in the peritoneal exudate of wt mice on day 6 after challenge. Unexpectedly, already on day 2 after challenge highly cytotoxic, TAg-specific CD8+ small intestinal intraepithelial lymphocytes (IEL) emerged in IL-10-/- mice but not in wt mice. When adoptively transferred, only CD8+ IEL from IL-10-/- mice but not conventional CD8+ CTL from wt mice, conferred to naïve wt recipients full protection against mKSA cells. Tumorigenicity of murine embryonic stem cells caused by serpin-CI- mediated protection against NK cells Undifferentiated human and murine embryonic stem (ES) cells express very low to undetectable levels of MHCI molecules. Fulfilling the "missing self" criterion, ES cells should be readily recognized and lysed by NK cells. However, ES cells were previously reported to be poorly lysed by NK cells, which was assumed to be due to low or missing expression of activating ligands for NK cells. Here, we report that murine ES cells were poorly lysed by either resting NK cells or activated NK cells although these NK cell populations recognized ES cells and secreted IFN-g in response to target cell contact. Murine ES cells express the serine protease inhibitor involved in cytotoxicity inhibition (SPI-CI). SPI-CI works as a specific inhibitor of granzyme M, a major component of the cytotoxic effector molecules stored in cytotoxic granules of NK cells. Knock down of SPI-CI by stable lentiviral expression of SPI-CI-specific shRNA (ES/shSPI-CI) sensitized ES cells for lysis by NK cells. After i.v. injection into syngeneic mice, ES/shSPI-CI cells were eliminated from the spleen more effectively than parental wt ES cells. ES/shSPI-CI cells implanted s.c. into syngeneic mice developed in only about 60% of the recipients very slowly growing tumors, barely detectable at 21 days post injection with average diameters below 1mm. This is in stark contrast to wt ES cells that gave rise to fast growing teratoma in all recipients with a mean diameter of more than 5mm at 21 days post injection. Our data suggest that constitutive expression of SPI-CI protects murine ES cells against lysis by NK cells in vitro and in vivo and thereby contributes to the tumorigenicity of ES cells.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Molekulare Interaktionen zwischen Effektorzellen und Zielzellen German
Translated abstract:	Abstract Language Einfluss von IL-4 und IL-10 auf CD8+ ZTL während der antigenspezifischen Tumor Abstoßung Für die Abstoßung von Tumoren sind hoch aktive, tumorspezifische zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten (ZTL) unbedingt notwendig. In dieser Arbeit wurde untersucht welchen Einfluss Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-10 (IL-10) auf tumorassoziierte, für das große Tumor-Antigen (TAg) des Simian Virus 40 (SV40) spezifische CD8+ T-Zellen, während der Abstoßung von syngenen SV40 transformierten mKSA Tumorzellen, in BALB/c Mäusen haben. Erstaunlicherweise führte die Belastung mit wenig Tumorzellen bei naiven IL-4-/- Mäusen, im Vergleich zu Wildtyp Mäusen, zu einer verlängerten, CD8+ T-Zell abhängigen Überlebenszeit. Bei mit SV40 TAg immunisierten IL-4-/- oder bei mit monoklonalem anti-IL-4 Antikörper behandelten Mäusen wurde eine stark erhöhte TAg-spezifische Zytotoxizität von tumorassoziierten CD8+ T-Zellen beobachtet. Diese gesteigerte Zytotoxizität in IL-4-/- Mäusen ging mit einem signifikant erhöhten Anteil von Granzyme A und B, und einer erhöhten spezifischen Aktivität von Granzyme B, in den tumorassoziierten CD8+ T-Zellen einher. Somit kann IL-4 die Generierung zytotoxischer Effektor Moleküle in CD8+ ZTL behindern, vor allem wenn eine eher schwache Immunantwort durch das Antigen hervorgerufen wird. In Interleukin (IL-) 10-defizienten Mäusen haben wir eine neue Population tumorantigenspezifischer, intraepithelialer Lymphozyten identifiziert. Diese zytotoxischen, CD8+ intestinalen intraepithelialen Lymphozyten (IEL) können wesentlich effektiver als konventionelle CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Tumorzellen eliminieren. TAg-immune IL-10-/- BALB/c stoßen mKSA Tumorzellen, die das große Tumorantigen des SV 40 Virus exprimieren, schneller ab als WT Mäuse. In WT Mäusen sind 6 Tage nach Tumorbelastung TAg-spezifische konventionelle CD8+ CTL in der Peritonealhöhle nachweisbar. Erstaunlicherweise konnten aus IL-10-/- Mäusen, aber nicht aus Wildtyp Mäusen, schon 2 Tage nach Tumorbelastung TAg-spezifische CD8+ intestinale intraepitheliale Lymphozyten isoliert werden. Während durch konventionelle T-Zellen kein Schutz vermittelt werden konnte, wurden naive Empfänger im adoptiven Transfer durch CD8+ IEL, von IL-10 -/- Mäusen, vollständig geschützt. Die Expression von SPI-CI schützt ES Zellen zum Teil vor NK Zellen und trägt zu der Bildung von Teratomen bei Undifferenzierte humane und murine embryonale Stammzellen (ES Zellen) exprimieren nur sehr wenig oder keine MHC Klasse I Moleküle auf der Oberfläche. Somit erfüllen ES Zellen, der "missing self Hypothese" zufolge, alle Vorraussetzungen als ideale Zielzellen für NK Zellen. Allerdings wurde bisher gezeigt, dass ES Zellen nur sehr schlecht von NK Zellen lysiert werden. Als Grund für die schlechte Lyse von ES Zellen durch NK Zellen wurde die geringe Expression von aktivierenden Liganden für NK Zellen auf ES Zellen vermutet. In dieser Arbeit zeigen wir, dass ES Zellen trotz der Tatsache, dass die verwendeten NK-Zellpopulationen ES Zellen gut erkennen und nach Kontakt große Mengen von IFNg sezernieren, nur gering von ruhenden und aktivierten NK Zellen lysiert werden. Murine ES Zellen exprimieren den Serin Protease Inhibitor SPI-CI, den spezifischen Inhibitor von Granzyme M. Granzyme M wiederum ist ein wichtiger Bestandteil der zytotoxischen Effektormoleküle, gespeichert in den zytotoxischen Granular von NK Zellen. Durch stabile Hemmung von SPI-CI, mit Hilfe von einem spezifisch für SPI-CI exprimierenden shRNA Vector (ES/shSPI-CI), konnte das Lyse-Niveau von ES Zellen durch ruhende oder aktivierte NK Zellen angehoben werden. Nach intravenöser Injektion in syngene Mäuse wurden die shSPI-CI Zellen bedeutend besser als die Wildtyp ES Zellen aus der Milz eliminiert. Auch nach subkutaner Injektion der shSPI-CI Zellen in syngene Mäuse konnte nur bei 60% der Empfänger, an Tag 21 nach Injektion, ein Tumor unter 1mm festgestellt werden. Im Gegensatz dazu entstanden aus subkutan implantierten Wildtyp ES Zellen in allen Empfängern schnell wachsende Tumore, mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 21mm. Die konstitutive Expression von SPI-CI schützt somit ES Zellen, in vitro und in vivo, vor der Lyse durch NK Zellen und trägt letztlich zu ihrer Tumorigenität bei. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Baschuk, Nikola nikola.baschuk@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-28540
Date:	2009
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language ES Zelle , SPI-CI , IELs German ES Cells , SPI-CI , IELs , Immune Surveillance of Cancer English
Date of oral exam:	28 June 2009
Referee:	Name Academic Title Krönke, Martin Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2854