Sequencing fragments of cryptophyte plastomes from 16S rRNA to rbcL genes and phylogenetic analyses based on the protein-encoding genes located in these fragments

Tran, Hoang-Dung (2009). Sequencing fragments of cryptophyte plastomes from 16S rRNA to rbcL genes and phylogenetic analyses based on the protein-encoding genes located in these fragments. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

In recent phylogenetic analyses combining nuclear and nucleomorph RNA genes of the ribosomal operons, three different colourless lineages were found in the genus Cryptomonas. This raised questions about the evolutionary history of these interesting objects and their relatives as well as the role of plastid genomes such as whether these three lineages resulted from similar or from different evolutionary events or what are the mutual relationship or/and roles of photosynthetic genes in the absence of photosynthetic activities, etc. To answer the interesting questions, the biological information has to been collected systematically from their plastid genomes. At the first stage of the thesis, the cryptophyte plastid rbcL gene (1,5- biphosphate carboxylase/oxygenase [RuBisCO] large subunit) was chosen to amplify by BioTherm� Taq DNA Polymerase and read their DNA compositions by SequiTherm EXCEL� II DNA Sequencing Kit-LC and Li-Cor 4200L bidirectional sequencer. Eighteen newly rbcL sequences of Cryptomonas strains were obtained. Of these, five sequences were from heterotrophic (colorless) strains and the remaining was from photosynthetic (pigmented) strains. The results of rbcL phylogeny analyses showed that the colorless C. paramecium and their closely relative photosynthetic Cryptomonas had increased their evolutionary rates significantly. These were congruent with those of nuclear rDNA (concatenated SSU rDNA, ITS2 and partial LSU rDNA) and nucleomorph SSU rDNA that had been examined in previously. They were combined with other result done by Dr. Kerstin Hoef-Emden such as analyzing the shift from NNC to NNU in two-fold degenerate NNY codon in rbcL gene in Cryptomonas to discuss some hypotheses of the loss of photosynthetic activities in the colorless C. paramaecium strains. Detail results and discussion were published in BMC Evolutionary Biology 2005; 5:56. In the second part of the thesis, the goals were to amplify the cryptophyte plastome 16S rRNA-rbcL fragments by MasterAmpTM Extra-long PCR kit and read their DNA sequences by BigDye Terminator v1.1 Cycle sequencing kit and automated ABI3730 sequencer, then exploited the sequencing information for further understanding the evolutionary history of cryptophyte plastomes. The task also attempted to find new evidence to explain the relationship between the changing from autotrophic to heterotrophic lifestyle in colorless Cryptomonas lineages and the elevation of evolutionary rates of photosynthetic genes that were located in the plastome 16S rRNA-rbcL fragment. Twenty-two cryptophyte strains (four of them were colorless) were participated in this part. Most of the fragments (15) were read completely as planned while several fragments (7) were not, due to lack of time. The colorless strains possessed the smallest fragments; their plastomes, thus, were predicted to be the smallest among those of Cryptomonas. Strain C. erosa CCAC 0018 and C. obovoidea CCAC 0031 seemed to have the largest plastomes as their 16S-rbcL fragments contained an additional gene � ycf26 � that was not found in other Cryptomonas strains. Advantages and disadvantages of long-range PCR and primer-walking sequencing combination were discussed. Based on the conserved domain analyses, all ycf26 from secondary plastids seems to be inactive and on the way to become pseudogene than alter its function. Another additional gene � ORF403 encoding Tic22 protein � also was examined the conserved domains and done a phylogenetic analysis. Some specific characteristics of ORF403 in rhodoplasts and cryptophyte plastome were found. Three protein-coding genes � chlI, rps4 and rbcL � were used as separated phylogenetic markers or in combined. The results confirmed that one colorless lineage (presented by CCAC 0056, CCAP 977/2a, M2452, M2180) had accelerated evolutionary rates in all gene or/and protein trees. The observations also suggested that chlI gene increased its substitution rate earlier than rps4 and rbcL genes as well as the elevated evolutionary rates could be ordered by chlI > rps4 > rbcL. Although having moderate size (609 bp), rps4 had an evolution rate neither as high as in chlI gene nor as low as in rbcL gene, producing acceptable phylogenetic trees for both nucleotide and protein levels. Therefore, rps4 gene seems to be more suitable protein-enoding plastid gene maker for phylogenies than its sisters, chlI and rbcL genes. The ratio of NNC to NNU in two-fold degenerate NNY codons was calculated for each gene and discussed. It is possible that the shift in codon usage from NNC to NNU did not correlate to the relaxation of functional constraints and/or reduction of gene expression levels. Furthermore, the usage of NNU codons over the NNC in two-fold degenerate NNY codon seemed to be controlled by neutral mutation pressure rather than by selection followed by the gradually acceleration of evolutionary rate. A hypothetical scenario for the relations among the loss of photosynthesis, increasing of substitution rate of interring genes and time of diverging in colorless lineages was discussed.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Sequencing-Bruchstücke von cryptophyte plastomes von 16 rRNA zu rbcL Genen und phylogenetic auf die Protein verschlüsselnden Gene beruhende Analysen gelegt in diesen Bruchstücken	German
Sequencing fragments of cryptophyte plastomes from 16S rRNA to rbcL genes and phylogenetic analyses based on the protein-encoding genes located in these fragments	English

Translated abstract:

Abstract

Language

In den letzten phylogenetische Analysen mit nuklearen und nucleomorph RNA-Gene der ribosomalen Operons wurden drei farblos verschiedenen Linienin der Gattung Cryptomonas gefunden. Diese Fragen über die evolutionäre Geschichte dieser interessanten Objekten und deren Angehörige sowie die Rolle der Plastiden Genome, ob diese drei Linien aus ähnlichen oder aus verschiedenen evolutionären Ereignisse oder sind die gegenseitigen Beziehungen und / oder Rollen der Photosynthese-Gene in das Fehlen der photosynthetischen Aktivitäten usw. Um diese interessanten Fragen zu antworten werden die biologischen Daten systematisch aus ihren Plastiden Genome gesammelt. In der ersten Phase des Thema wurde rbcL Gene in den cryptophyten Plastiden (1,5-biphosphate Carboxylase / Oxygenase [RuBisCo] großen Untereinheit) zur Ergänzung von Biotherm� Taq DNA Polymerase gewaehlt und zum Lesen der DNA-Kompositionen von SequiTherm EXCEL� II DNA-Sequenzierung Kit-LC und Li-Cor 4200L. Achtzehn von rbcL Sequenzen Cryptomonas wurden gesammelt. Fünf davon Sequenzen wurden aus heterotrophen (farblos) und die übrigen Teile wurde von photosynthetischen (pigmentiert) gesammelt. Die Ergebnisse der rbcL Phylogenie Analysen zeigten, dass die farblose C. paramecium und ihre eng relative photosynthetische Cryptomonas ihre evolutionäre Entwicklung deutlich hatten. Diese waren deckungsgleich mit denen der nuklearen rDNA (verketteten SSU rDNA, ITS2 und teilweise LSU rDNA) und nucleomorph SSU rDNA, die in zuvor geprüft worden. Sie wurden zusammen mit anderen Ergebnis von Dr. Kerstin Hoef-Emden, wie die Analyse der Verschiebung von NNC zu NNU in zwei-fach entartet NNY Codons in rbcL Gen in Cryptomonas zu diskutieren einige Hypothesen der Verlust der photosynthetischen Aktivitäten in den farblos C. paramaecium Stämme. Detaillierte Ergebnisse und Diskussionen wurden in BMC Evolutionary Biology 2005, 5:56 veroeffentlicht. Im zweiten Teil der Doktorarbeit sind die Ziele zur Ergänzung der cryptophyten plastome 16S rRNA-rbcL Fragmente von MasterAmpTM Extra-lange PCR Kit und lesen die DNA-Sequenzen von BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing-Kit und automatisierte ABI3730 Sequenzer, dann nutzte die Sequenzierung Informationen für das Verständnis der Evolutionsgeschichte der cryptophyten plastomes. Die Aufgabe auch versucht, neue Beweismittel zu erklären, das Verhältnis zwischen dem Wechsel von autotrophen zu heterotrophen Lebensweise in farblose Cryptomonas-Linien und die Höhe der Evolution von photosynthetische Gene, die in der plastome 16S rRNA-rbcL Fragment sind. Zweiundzwanzig cryptophyte Stämme (vier von ihnen wurden farblos) waren an diesem Teil. Die meisten der Fragmente (15) wurden vollständig lesen wie geplant, während mehrere Fragmente (7) nicht wegen Mangel an Zeit wurden. Die farblose Stämme im Besitz der kleinsten Fragmente, deren plastomes, so wurden vorhergesagt, werden die kleinsten unter den von Cryptomonas. Stamm C. erosa emend CCAC 0018 und C. obovoidea emend CCAC 0031 zu haben schien die größte plastomes als 16S rRNA-rbcL Fragmente enthalten ein zusätzliches Gen - ycf26 - das war nicht in anderen Cryptomonas Stämme. Vor-und Nachteile der Langstrecken-und PCR-Primer-Walking-Sequenzierung Kombination erörtert. Auf der Grundlage der erhaltenen Domain-Analysen scheinen alle ycf26 von sekundären Plastiden inaktiv zu sein und auf dem Weg zu pseudogene als ihre Funktion verändern. Eine weitere zusätzliche Gen - ORF403 Codierung Tic22 Protein - auch wurde die konservierte Domänen und phylogenetische Analyse geleistet. Einige Besonderheiten der ORF403 in rhodoplasts und cryptophyten plastome wurden gefunden. Drei Protein-kodierenden Gene � chlI, rps4 und rbcL - wurden als phylogenetische Marker getrennt oder in Kombination. Die Ergebnisse bestätigten, dass ein farbloses Linie (von CCAC 0056, CCAP 977/2a, M2452, M2180) beschleunigten evolutionären in allen Gen-und / oder Protein-Bäume hatte. Die Beobachtungen auch darauf hin, dass chlI Gen erhöhte seine Substitution Rate früher als rps4 und rbcL Gene sowie die erhöhten Sätze nach chlI> rps4> rbcL evolutionären könnte. Obwohl mit mäßiger Größe (609 bp), rps4 eine Entwicklung Rate weder so hoch wie in chlI -Gen noch so niedrig wie in rbcL Gen produziert akzeptabel phylogenetische Bäume für beide Nucleotid-und Protein-Ebene war. Daher rps4 Gen scheint besser geeignet enoding Plastiden-Protein-Gen-Maker für phylogenies als seine Schwestern, Chli und rbcL Gene zu sein. Das Verhältnis von NNC auf NNU in zwei-fach entartet NNY Codons wurde für jedes Gen und diskutiert. Es ist möglich, dass die Verschiebung der Codon-Nutzung von NNC zu NNU korrelierte nicht zur Entspannung der funktionellen Einschränkungen und / oder Verringerung der Genexpression Ebenen. Außerdem ist die Nutzung von NNU Codons über die NNC in zwei-fach entartet NNY Codon durch neutrale Mutation Druck und nicht durch Auswahl, gefolgt von der schrittweise Beschleunigung der evolutionären Kurs Ein mögliches Szenario für die Beziehungen zwischen den Verlust der Photosynthese, der zunehmenden Substitution von interring Gene und Uhrzeit der unterschiedlichen Linien war in farblos.

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