Universität zu Köln

Engmann, Tanja (2009). Structural, physical and genetic interactions of the i-AAA protease Yme1 in Saccharomyces cerevisiae. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The i-AAA protease Yme1 is a highly conserved ATP-dependent AAA (ATPase Associated with various cellular Activites) protease anchored to the inner mitochondrial membrane where it mediates protein quality surveillance that is crucial for cell survival. In yeast, deletion of YME1 is associated with pleitropic phenotypes. However, the few known proteolytic substrates and interaction partners of the i-AAA protease cannot explain the molecular basis of these phenotypes. Therefore, different approaches were used to define the function of the i-AAA protease. First, affinity purification of a proteolytic inactive variant of Yme1 working as a substrate trap was employed and led to the identification of eight novel Yme1-interacting proteins that localise to different submitochondrial compartments. Subsequent analysis revealed that two interactors, Mcr1 and Mpm1, represent new proteolytic substrates of the i-AAA protease. Hence, additional functions of the i-AAA protease should be responsible for the other identified interactions. Second, insights into processes that require the function of the i-AAA protease were obtained by a synthetic genetic array (SGA) approach using an assorted library of 96 non-essential mitochondrial gene deletions. 34 identified synthetic lethal interaction potentially link Yme1 to new functions like mitochondrial morphology, protein processing and lipid metabolism. Finally, the synthetic lethal interaction of IMP1 and YME1 was analysed by a high copy suppressor screening. This interaction is of particular interest, as all substrates of the Imp1 catalytic subunit of the IMP processing peptidase could be co-purified with the i-AAA protease. The identified suppressor Pgk1, a key enzyme in glycolysis and gluconeogenesis, suggests a severe impairment of Deltayme1Deltaimp1 cells in energy metabolism. Moreover, in this thesis the substrate recognition by the i-AAA protease was examined by mutational analysis. Recently, two substrate binding regions have been identified within Yme1: the CH-(C-terminal helices) and the NH-(N-terminal helices) region. In contrast to the NH-region, the molecular mechanism of substrate binding to the CH-region has not been studied so far. Here, the CH-region was not only identified to have a role in substrate binding and transfer to the proteolytic cavity, but also for the stabilisation of the i-AAA protease complex. Taken together, novel substrates and interaction partners of the i-AAA protease were identified, pointing to additional functions of Yme1 independent of its proteolytic activity. As only few approaches have addressed the function of the i-AAA protease in higher eukaryotes so far, it will be interesting to examine the relevance of these findings for mammals.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Strukturelle, physikalische und genetische Interaktionen der i-AAA Protease Yme1 in Saccharomyces cerevisiae German
Translated abstract:	Abstract Language Die i-AAA Protease Yme1 ist eine hochkonservierte ATP-abhängige AAA (ATPase Associated with various cellular Activites) Protease, die in der inneren mitochondrialen Membran verankert ist und dort die Qualität der Proteine überwacht; dies ist entscheidend für das Überleben der Zelle. In Hefe ist eine Deletion des YME1 Gens mit pleiotropen Phänotypen assoziiert. Der molekulare Hintergrund dieser Phänotypen kann jedoch nicht mit den bislang bekannten proteolytischen Substraten und Interaktionspartner von Yme1 erklärt werden. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Ansätze angewandt, um die Funktion der i-AAA Protease genauer zu definieren. Zunächst wurden mit Hilfe von Affinitäts-aufreinigung einer proteolytisch inaktiven Variante von Yme1, die als Substratfalle dient, acht neue Interaktionspartner aus unterschiedlichen mitochondrialen Subkompartimenten identifiziert. Zweien dieser Interaktionspartner, Mcr1 und Mpm1, wurde eine Rolle als proteolytisches Substrat der i-AAA Protease zugewiesen. Für weitere identifizierte Interaktionen sollten andere Funktionen der i-AAA Protease verantwortlich sein. Ferner wurde ein "synthetisch genetischer Array" (SGA) mit 96 nicht-essentiellen mitochondrialen Gendeletionen verwendet, um Prozesse zu untersucht, welche auf die Funktion der i-AAA Protease angewiesen sind. 34 synthetisch letale Interaktionen stellten eine mögliche Verbindung von Yme1 zu neuen Funktionen, wie der mitochondrialen Morphology, der Prozessierung von Proteinen und dem Metabolismus von Lipiden her. Außerdem wurden Suppressoren der synthetisch letalen Interaktion von IMP1 und YME1 gesucht. Diese genetische Interaktion ist insofern von besonderem Interesse, da alle bekannten Substrate der katalytischen Untereinheit Imp1 der IMP Prozessierungs-Peptidase als Interaktions-partner der i-AAA Protease identifiziert wurden. Dabei wurde ein entscheidendes Enzym der Glykolyse und Glukoneogenese, Pgk1, als Suppressor der Deltayme1Deltaimp1 Doppelmutante gefunden. Dies deutet auf eine Beeinträchtigung des Energiemetabolismus in diesen Zellen hin. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit die Bedingungen der Substraterkennung der i-AAA Protease mit Hilfe von Mutationsanalysen untersucht. Kürzlich konnte die Existenz von zwei Substratbindestellen der i-AAA Protease gezeigt werden: die CH-(C-terminale Helices) und die NH-(N-terminale Helices) Region. Im Gegensatz zur NH-Region wurden bislang keine Untersuchungen zu molekularen Mechanismen der Substratbindung der CH-Region durch-geführt. Hier konnte zusätzlich zur Signifikanz der CH-Region für die Substratbindung und -übermittlung, eine Funktion dieser Region in der Stabilisierung des i-AAA Proteasekomplexes identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Substrate und Interaktionspartner der i-AAA Protease identifiziert, die auf die Existenz weiterer Funktionen von Yme1 hindeuten. Da nur wenige Erkenntnisse über die Funktion der i-AAA Protease in höheren Eukaryoten vorliegen, wird eine Analyse der Bedeutung der hier erlangten Befunde in Säugern interessant. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Engmann, Tanja t.engmann@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-29100
Date:	2009
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Mitochondrial quality control, AAA proteases English
Date of oral exam:	19 May 2009
Referee:	Name Academic Title Langer, Thomas Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2910