Molekulare Analyse der epigenetischen Regulation der SMN2-Genaktivität in der Pathogenese der spinalen Muskelatrophie (SMA)

Hauke, Jan Henning (2009). Molekulare Analyse der epigenetischen Regulation der SMN2-Genaktivität in der Pathogenese der spinalen Muskelatrophie (SMA). PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

Preview

PDF
DissertationHauke.pdf
Download (3MB)

Abstract

Die wichtigsten Mechanismen der epigenetischen Genregulation sind die Methylierung von DNA an Cytosinbasen in CpG-Dinukleotiden und die Modifikation von Histonen durch Acetylierung, Methylierung, Sumoylierung und Ubiquitinilierung. Die DNA-Methylierung und die Acetylierung von Histonen sind dabei nicht nur getrennt wirkende Repressoren der Transkription, welche die Zugänglichkeit der DNA oder des Chromatins verändern, sondern diese Mechanismen interagieren miteinander. Die proximale spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine autosomal rezessiv erbliche neuromuskuläre Erkrankung, die durch die Degeneration von alpha-Motoneuronen im Rückenmark gekennzeichnet ist. Als molekulare Ursache konnten Deletionen/ Mutationen des survival of motor neuron gens 1 (SMN1) gefunden werden. Der Schweregrad der Erkrankung wird hauptsächlich durch die Anzahl der SMN2-Genkopien bestimmt. Je größer die Anzahl an SMN2-Kopien, desto wahrscheinlicher ist ein milderer Verlauf der Erkrankung. Das SMN2-Gen bildet auf Grund einer Mutation, die das Spleißen der prä-mRNA beeinflusst, nur etwa 10% des funktionellen Volllänge-SMN-Proteins im Vergleich zum SMN1-Gen. Die Korrelation des Phänotyps mit der Anzahl an SMN2-Genkopien ist nicht absolut: So können Patienten mit der gleichen Anzahl an SMN2-Genkopien an unterschiedlichen Schweregraden der SMA erkranken. Daher ist zu vermuten, dass die SMN2-Genkopien bei diesen Patienten funktionell nicht äquivalent sind. Durch eigene Vorarbeiten und die Quantifizierung der Methylierung mittels Pyrosequenzierung konnte gezeigt werden, dass die Promotorregionen der SMN-Gene vier CpG-Inseln enthält (SMNCGI 1 bis 4). Die Quantifizierung der SMN2-Methylierung in SMA-Fibroblasten und der SMN1- sowie SMN2-Methylierung in Blutproben von SMA-Patienten zeigte, dass SMNCGI 1 und 4 hypermethyliert sind (>70% Methylierung). SMNCGI 2 hat eine Länge von 223 bp und einen GC-Gehalt von 58,3%; es reicht von Position -469 bis -247 relativ zum Translationsstartpunkt (ATG) der SMN-Gene. Dieses CGI enthält den ersten Transkriptionsstartpunkt der SMN-Genkopien und ist nur teilweise methyliert. SMNCGI 3 ist mit 446 bp die größte der vier CpG-reichen Regionen und erstreckt sich von Position -151 bis +295 (GC-Gehalt: 62,1%). Für diese Region konnten nur sehr geringe Methylierungswerte festgestellt werden; es ist daher die einzige "klassische" CpG-Insel im Promotor der SMN-Genkopien. Der Vergleich der Methylierung der SMN2-Genkopien im Blut von SMN1-deletierten SMA Typ I und Typ III Patienten, die 2 SMN2-Genkopien aufweisen, zeigte unter anderem an den Positionen -296 und -290 im SMN2CGI 2 signifikante Methylierungs-unterschiede, die mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelieren. Diese Unterschiede konnten auch in SMA-Fibroblasten mit 2 SMN2-Genkopien gefunden werden, die von Patienten mit unterschiedlichem SMA-Schweregrad stammen (TypI und Typ IIIa/b). Interessanterweise entspricht die Position -296 genau dem ersten Transkripttionsstartpunkt der SMN-Genkopien. Die Transkriptanalyse mittels quantitativer real-time PCR in den SMA-Fibroblasten zeigte eine inverse Korrelation der Expression von diesem Transkriptionsstartpunkt (LT-SMN2) mit der Methylierung an den Positionen -296 und 290. Die Expression dieses SMN2-Transkripts wird also durch DNA-Methylierung gehemmt. Mittels EMSA (electrophoretic mobility shift assay) Analysen konnten DNA-Proteinkomplexe im Bereich des ersten Transkriptionsstartpunktes nachgewiesen werden. Durch Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) konnte gezeigt werden, dass die Stilllegung der Expression mittels DNA-Methylierung durch das MeCP2-Protein vermittelt wird, welches methylierungsabhängig in der kritischen Promotorregion bindet. Die Analyse der Expression des LT-SMN2 in humanem embryonalem Gewebe und in Geweben von SMA-Mausmodellen zeigte eine stärkere Expression des LT-SMN2 in neuronalen Geweben. Allerdings zeigten die untersuchten SMA-Mausmodelle im SMN2CGI 2 deutliche weniger Methylierung als die untersuchten humanen Proben. Diese Ergebnisse geben Anlass zu der Vermutung, dass die Methylierung an den Positionen -296 und -290 des SMN2-Gens in neuronalem Gewebe funktionell relevant ist und so den Krankheitsverlauf der SMA moduliert. Die Untersuchungen mit verschiedenen HDAC Inhibitoren in Fibroblasten und organotypischen Hirnschnittkulturen zeigten, dass nur panHDAC-Inhibitoren wie Vorinostat (SAHA) oder Romidepsin (FK-228) in der Lage sind die Stilllegung der SMN2-Transkription wirksam zu umgehen. Der knock-down von MeCP2, E2F1, der gesamten HDAC-Klasse I Gene sowie der HDAC-Klasse I Gene und MeCP2 bewirkte jeweils eine Steigerung der LT-SMN2-Expression, aber nur durch den knock-down von E2F1 konnte auch die SMN2-Gesamttranskriptmenge signifikant gesteigert werden.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

The expression of eukaryotic genes is not only regulated by their promotor sequence but also by epigenetic factors. The most important factors of epigenetic gene regulation are DNA methylation at cytosins in CpG-dinucleotides and acetylation of the histones around which the DNA is wrapped in the nucleus. These two fundamental mechanisms of epigenetic gene regulation have shown to be interlinked. Methylation of CpG-dinucleotides for example enables the binding of the MBD (methyl-CpG-binding domain) transcription factors like MeCP2, which are able to recruit chromatin remodelling complexes with HDAC activity to the promotor and represses the transcriptional activity via the acetylation of histones. During this thesis the epigenetic SMN2 gene regulation and its role in the pathogenesis of spinal muscular atrophy (SMA) were analysed in detail. Proximal spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive inherited neuromuscular disorder, which is characterized by the degeneration of -motoneurons in the anterior horns of the spinal cord. The molecular cause of the disease are homozygous deletions of the survival motor neuron gene 1 (SMN1) in 96% of patients, intragenic mutations of SMN1 are rare. Within the SMA region on chromosome 5q13 the human survival motor neuron gene exists in two copies SMN1 and SMN2 which encode identical proteins and are ubiquitously expressed. Due to a C to T transition within exon7 the SMN2 gene copy produces only about 10% of fullength transcripts and protein compared to SMN1. The SMA disease severity correlates with the SMN2 copy number; the higher the number of SMN2 copies the more likely a milder phenotype is. However this correlation is not absolute, suggesting that the SMN2 gene copies are functionally not equivalent or the existence of other factors which can modulate the disease progression. My preliminary work and the quantification of methylation via pyrosequencing showed, that the promotor region of the SMN genes contains four CpG-islands (SMNCGI 1-4). The analysis of the SMN2 methylation in blood samples and fibroblast as well as the SMN1 methylation analysis in blood samples revealed that SMNCGI 1 and SMNCGI 4 are hypermethylated (>70%). The second CpG island (SMNCGI 2) with a GC content of 58.3% has a size of 223 nt and ranges from position -469 to -247 relative to the translational start site (ATG). This CpG island contains the first transcription start site (TSS) of the SMN gene copies and analysis revealed it to be only partially methylated. SMNCGI 3 is the largest of the four CpG-islands with a size of 446 nt from position -151 to +295 and a GC-content of 62.1%. This CpG island showed only very low methylation levels and therefore is the only "classical" CGI in the SMN promotor region. The comparison of methylation levels in DNA from blood and fibroblast between severely affected SMA type I patients and milder affected type III patients revealed significant lower methylation levels at two adjacent sites (-296 and -290) in the type III patients. Interestingly, the CpG dinucleotide at position -296 co-localizes with the first TSS indicating that DNA methylation at this position is linked with transcriptional silencing of expression from this TSS (LT-SMN2). Analysis in fibroblasts revealed an inverse correlation between LT-SMN2 expression and methylation at positions -296 and -290. The analysis of the promotor region surrounding the first TSS by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) analysis revealed the sequence specific binding of protein to this region, which was not influenced by methylation. By using chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis I was able to show, that silencing of LT-SMN2 transcription via methylation is mediated by the MeCP2 protein, which binds the critical promotor region in a methylation dependent manner. The analysis of LT-SMN2 levels in human embryonic tissues and murine tissues from SMA mouse models revealed a higher expression of LT-SMN2 in neuronal than in non neuronal tissues. These results suggest that methylation at position -296 and -290 is functionally relevant and modulates the SMA disease severity in the presence of identical SMN2 copy numbers. Analysis with different HDAC-inhibitors (HDACis) in SMA fibroblasts and human organotypic hippocampal brain slice cultures (OHSCs) revealed that panHDACis like Vorinostat (SAHA) or Romidepsin (FK-228) are able to bypass SMN2 gene silencing by DNA methylation, whereas others like valproic acid (VPA) or phenylbutyrate which are under clinical investigation for SMA therapy do not. Taken together these results show, that DNA methylation seems to be important for the course of the disease as well as for pharmacological SMN2 gene activation, which might be interesting for future therapy regimens. Especially panHDACis are more potent in SMN2 gene activation and good new candidates for the treatment of SMA, if the drugs tested so far do not show the desired results.

English

Creators: