Structural and functional characterization of natural alleles of potato (Solanum tuberosum L.) invertases associated with tuber quality traits

Draffehn, Astrid (2010). Structural and functional characterization of natural alleles of potato (Solanum tuberosum L.) invertases associated with tuber quality traits. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Stärke- und Zuckergehalt von Kartoffelknollen sind ausgezeichnete Beispiele, die molekularen Grundlagen von quantitative trait loci (QTLs) mittels Kandidatengenen zu identifizieren, da der Kohlenhydratstoffwechsel auf funktionaler Ebene einer der best untersuchten Prozesse in pflanzlichen Organismen ist. So wurden viele Gene aus Kartoffel und anderen Pflanzen, die mit dem Kohlenhydratstoffwechsel und -transport verbundenen sind, kloniert und hinsichtlich ihrer Funktion analysiert. Stärke- und Zuckergehalt beeinflussen unmittelbar die Qualität frischer Kartoffeln und weiter verarbeiteter Kartoffelprodukte wie zum Beispiel Kartoffelchips und Pommes Frites. Biochemische und genetische Daten deuten darauf hin, dass Invertase (Beta-D-fructofuranosidase) an der Kontrolle des Stärke- und Zuckergehaltes von Kartoffelknollen beteiligt ist. Deshalb wurde der Focus dieser Arbeit auf Invertasen gelegt, die universell verbreitet sind und Saccharose in die reduzierenden Zucker Glukose und Fruktose spalten. Eine durch Kaltlagerung bedingte Erhöhung an reduzierenden Zuckern in der Knolle ist abhängig von der Kartoffelsorte und äußert sich in einer Verschlechterung der Kartoffelchipsqualität, zum Beispiel dunklerer Farbe, bitterer Geschmack und einer höheren Konzentration von Acrylamid. In dieser Doktorarbeit wurden natürlich vorkommende Allele von Kartoffelinvertasen, welche signifikant mit dem Stärke- und Zuckergehalt von Kartoffelknollen assoziiert sind (LI ET AL., 2005, 2008), hinsichtlich ihrer molekularen und biochemischen Eigenschaften charakterisiert. Die analysierten Gene waren Pain-1 auf Chromosom III, invGE und invGF auf Chromosom IX, und pCD111 und pCD141 auf Chromosom X. Durch Klonieren von cDNA der fünf bekannten Invertasegene aus Kartoffel mittels PCR, konnten 64 Allele der unterschiedlichen Gene identifiziert werden. Weiterhin zeigte eine phenetic tree- Analyse, basierend auf Aminosäureähnlichkeiten der verschiedenen Invertaseisoformen, dass vakuoläre und apoplastische Invertasen in separate Klassen gegliedert werden können. Diese Einteilung wurde durch die unterschiedliche Genstruktur und -organisation der Isoformen, welche durch Isolation und Sequenzierung von entsprechenden BACs gewonnen wurde, bestätigt. So weisen die Gene pCD111 und pCD141 jeweils sechs Exons und fünf Introns auf und sind in einer direkten Tandem-Reihung angeordnet. Das Gen Pain-1 enthält sieben Exons und sechs Introns, ohne ein Tandemduplikat aufzuweisen. Weiterhin wurden die durch allelische Aminosäuren ausgelösten strukturellen Veränderungen der Invertaseallele, mittels 3D-Analyse veranschaulicht. Allele, die nachweislich mit einer guten Kartoffelchipsqualität assoziiert sind, zeichneten sich durch Ladungsveränderungen in der potenziellen Saccharose-Bindedomäne des Enzyms aus. Diese Veränderungen führen möglicherweise zu einer verringerten Saccharosebindung und einer geringeren Konzentration an Glukose und Fruktose, was wiederum die Qualität von Kartoffelchips beeinflusst. Weiterführend wurde überprüft, ob allelspezifische Aminosäurenvariationen zu einer veränderten Enzymaktivität führen können. Hierzu wurden die Enzymaffinität zu Saccharose (Km) und die Rate der Saccharoseumwandlung (vmax) von Invertaseallelen aus Kartoffel mit Hilfe der Hefemutante SUC2 analysiert. Die Messungen zeigten keine biochemischen Unterschiede zwischen apoplastischen und vakuolären Invertaseallelen, welche die Assoziation mit Kartoffelchipsqualität hätten erklären können. Zusätzlich wurde mittels Expressionsanalyse veranschaulicht, dass allelische Transskriptionsmuster verschiedener Invertaseisoformen genotypspezifisch sind. Zusammenfassend ist fest zu stellen, dass an diesem Punkt der Arbeit keine absolute Aussage über den funktionalen Einfluss der beschriebenen Invertaseallele auf Kartoffelchipsqualität möglich ist. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass Invertaseregulation sowohl auf Transskript- als auch auf Proteinebene erfolgt, genotypspezifisch ist und von der Sequenzvariation der Allele abhängt. Diese Arbeit ist ein erstes Beispiel für einen ebenenübergreifenden Ansatz, die natürlich vorkommende Variation des Stärke- und Zuckergehalts in Kartoffelknollen auf molekularer Ebene zu entschlüsseln.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Strukturelle und funktionelle Charakterisierung natürlicher Invertaseallele aus Kartoffel (Solanum tuberosum L.), die mit Knollenqualitätsmerkmalen assoziiert sind	German

Translated abstract:

Abstract

Language

The starch and sugar content of potato tubers are model traits for a candidate gene approach towards understanding the molecular basis of quantitative trait loci (QTL) because carbohydrate metabolism is one of the best studied plant processes at the functional level. Many genes of potato and other plant species involved in carbohydrate metabolism and transport have been cloned and functionally characterized. The starch and sugar content influences the nutritional quality of fresh potatoes and processed products, such as potato chips and French fries. Biochemical and genetic data suggest that genes encoding invertases (Beta-D-fructofuranosidase) participate in the control of starch and sugar content of the potato tubers. In this context, the focus was on invertases, which are ubiquitous enzymes hydrolyzing sucrose into the reducing sugars glucose and fructose. Under cold storage, reducing sugars accumulate in a genotype dependent manner in tubers (cold sweetening). High reducing sugar levels result in a reduction of potato chips quality e.g. darker chips colour, bitter taste, and a higher acrylamide concentration. In this PhD work natural alleles of potato invertases, found previously to be significantly associated with tuber starch and sugar content (LI ET AL., 2005, 2008), were characterized at the molecular and biochemical level. Starting point was the PCR based cloning of cDNAs encoded by the five known potato invertase genes Pain-1 on chromosome III, invGE and invGF on chromosome IX, and pCD111 and pCD141 on chromosome X, which resulted in 64 distinct alleles. Phenetic tree analysis based on amino acid similarity separated the alleles of cell wall and vacuolar invertases into two classes. This was also in line with the genomic organization of the different invertase loci. The genomic structures of the Pain-1 locus and the gene pair pCD111/pCD141 were unravelled by isolation and sequence analysis of corresponding BACs. The genes pCD111 and pCD141 consist each of six exons and five introns, and are arranged in a direct tandem repeat. The gene Pain-1 comprises seven exons and six introns without a tandem duplication. Furthermore, structural alterations due to allelic invertase amino acid sequence variation were clarified by 3D-model analysis. Alleles associated with superior potato chips quality showed charge differences in the putative sucrose binding site possibly resulting in a lower conversion of sucrose in reducing sugars, which could influence potato chips quality. To test whether allele specific amino acid variations lead to altered enzyme activities, potato invertases were assayed in the yeast invertase mutant SUC2. Measurements of enzyme affinity to sucrose (Km) and rate of sucrose conversion (vmax) did not show differences between vacuolar and cell wall-bound invertase alleles, which could explain the association with chips quality. Expression analysis revealed genotype specific transcription patterns of the alleles from different invertase isoforms. In conclusion, at this point no definite statement on the functional impact of the characterized invertase alleles on potato chips quality is possible. The results of this study show that invertase regulation takes place at the transcript as well as at the protein level, is genotype specific and depends on allelic sequence variation. This work is a first example of a multi-pronged approach to dissect the natural variation of sugar and starch content in potato at molecular level.

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