Analysis of the interaction of the LuxR-type transcription factors BglJ and RcsB and antagonism of H-NS mediated silencing in Escherichia coli

Ganesan, Raja Venkatesh (2010). Analysis of the interaction of the LuxR-type transcription factors BglJ and RcsB and antagonism of H-NS mediated silencing in Escherichia coli. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

The nucleoid-structuring protein H-NS is one of the most abundant DNA-binding protein in Enterobacteriaceae. H-NS plays a crucial role in the organization of the bacterial chromosome and in gene regulation. In E. coli H-NS regulates approximately 5% of genome by mostly acting as a transcriptional repressor. H-NS regulates gene expression in response to various environmental stimuli. H-NS act as a global transcriptional repressor by binding to specific sites followed by forming nucleoprotein complexes and DNA-H-NS-DNA bridges which prevent transcription initiation. H-NS mediated repression can be antagonized by specific transcription factors. This was shown for several H-NS repressed loci including the silent bgl operon in E. coli, which is a model system for studying H-NS mediated repression. Silencing of bgl is relieved by the LuxR-type transcription factor BglJ. This anti-silencing effect of BglJ is RcsB dependent. RcsB is a response regulator of a membrane stress induced Rcs signal transduction system which regulates various cellular processes in Enterobacteriaceae. BglJ is a LuxR-type transcriptional regulator encoded in an operon with YjjQ. Previous two-hybrid analysis suggested that RcsB interacts with BglJ and also with YjjQ. In this present study the interaction of RcsB with BglJ and YjjQ was analyzed by Co-immunoprecipitation studies, which showed that RcsB interacts well with BglJ and weaker with YjjQ. Analysis of BglJ protein stability suggests that it is a target of Lon protease target and a second protease. Binding of BglJ-RcsB to a proposed putative RcsB/BglJ heterodimer binding site in the bgl regulatory region was supported by linker insertion mutant analysis in the putative binding site. Binding analyses by DNA shift assays indicate that binding of RcsB to a known target gene (osmC) at which act as homodimer is stimulated by H-NS, while binding analyses of BglJ-RcsB to its putative binding site in bgl could not yet be confirmed by DNA shift assays, as BglJ protein purification failed. In addition, DNA microarray experiments showed that constitutive expression of BglJ causes a significant increase in genes involved in acid resistance, stress response, iron transport, inner and outer membrane proteins suggesting a wide spread role of BglJ. Taken together, the data support the model that RcsB forms a heterodimer with BglJ, that the RcsB-BglJ heterodimer antagonizes H-NS in bgl, and that it RcsB-BglJ plays an important role in global gene regulation.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Analysis of the interaction of the LuxR-type transcription factors BglJ and RcsB and antagonism of H-NS mediated silencing in Escherichia coli	English

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Abstract

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Das nukleoid-strukturierende Protein H-NS ist eines der häufigsten DNA bindenden Proteine in Enterobacteriaceae. H-NS spielt eine Schlüsselrolle in der Organisation des bakteriellen Chromosoms und in der Regulation von Genaktivität. Als Repressor der Transkription reguliert H-NS in Escherichia coli die Aktivität von etwa 5 % des Genoms. Dabei reguliert es Genexpression in Antwort auf verschiedene Umweltsignale. H-NS wirkt dabei als globaler Repressor, indem es an spezifische DNA-Sequenzen bindet, woraufhin sich stabile Nukleoproteinkomplexe und H-NS DNA H-NS-Brücken ausbilden, welche die Transkriptionsinitiation verhindern können. Der H-NS-vermittelten Repression kann durch spezifische Transkriptionsfaktoren entgegengewirkt werden. Dieses Prinzip wurde bereits für mehrere H-NS-reprimierte Genloci gezeigt, z. B. für das bgl-Operon in E. coli, das als modellhaft für den Mechanismus der Repression durch H-NS gilt. Am bgl-Operon kann der LuxR-Typ-Transkriptionsfaktor BglJ die Repression durch H-NS aufheben, wobei der Antirepressoreffekt von BglJ abhängig ist von RcsB. RcsB ist der Antwortregulator des Rcs-Signaltransduktionssystems, das durch Membranstress aktiviert wird und zahlreiche zelluläre Prozesse in Enterobacteriaceae reguliert. BglJ ist ein Trasnkriptionsfaktor vom LuxR-Typ und ist gemeinsam mit YjjQ in einem Operon kodiert. Frühere Analysen in einem Two-Hybrid-System ließen darauf schließen, dass RcsB sowohl mit BglJ als auch mit YjjQ interagieren kann. In der vorliegenden Studie wurde die Interaktion von RcsB mit BglJ und YjjQ mittels Co-Immunopräzipitation-Experimenten untersucht, die zeigten, dass RcsB eindeutig mit BglJ und weniger eindeutig mit YjjQ interagiert. Eine Analyse der Proteinstabilität von BglJ legte die Vermutung nahe, dass BglJ ein Substrat der Protease Lon und einer zweiten, unbekannten Protease ist. Die Vermutung, dass das Heterodimer BglJ-RcsB an eine Bindestelle in der Promotorregion des bgl-Operons bindet, wurde durch eine Analyse von Linker-Insertions-Mutanten der vermuteten Bindestelle unterstützt. Bindestudien mithilfe von DNA-Gelretardationsversuchen zeigten, dass die Bindung von RcsB an ein bekanntes Zielgen (osmC) durch die Anwesenheit von H-NS stimuliert wurde, während eine Bindung von BglJ-RcsB an die vermutete Zielsequenz am bgl-Operon in diesen Ansätzen nicht bestätigt werden konnte, da die Aufreinigung von BglJ-Protein misslang. Desweiteren zeigten DNA-Microarray-Experimente, dass konstitutive Expression von BglJ zu einer signifikant höheren Transkription von Genen führte, die an zellulären Prozessen wie Säureresistenz, Stressantwort und Eisentransport beteiligt sind, sowie von Genen für Proteine der inneren und der äußeren Zellmembran. Diese Ergebnisse deuten auf eine globale Rolle von BglJ hin. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass BglJ und RcsB Heterodimere bilden können, welche die Repression des bgl-Operons durch H-NS aufheben können. Darüber hinaus wird deutlich, dass BglJ-RcsB eine wichtige Rolle als globaler Genregulator spielt.

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