The PHO2 family of ubiquitin conjugating enzymes in Arabidopsis thaliana and its contribution to plant programmed cell death

Eifler, Karolin (2010). The PHO2 family of ubiquitin conjugating enzymes in Arabidopsis thaliana and its contribution to plant programmed cell death. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

Preview

PDF
Karolin_Eifler_Dissertation.pdf
Download (14MB)

Abstract

Programmed cell death (PCD) is essential for various developmental processes and stress responses in the life cycle of a plant. The ubiquitin-proteasome system has been shown to regulate multiple mechanisms with a suspected role in the initiation and execution of plant programmed cell death. However, only little is known about the exact function of enzymes involved in ubiquitylation during cell death responses. This thesis gives first insights into the molecular and physiological characteristics of the PHO2 family of ubiquitin conjugating enzymes in Arabidopsis thaliana and demonstrates the important role of these proteins during the programmed cell death response to abiotic and biotic stresses. The protein family consists of four members that are unusually large for ubiquitin conjugating enzymes and possess in addition to the characteristic UBC domain a long N-terminal extension and a C-terminal domain highly conserved throughout the plant kingdom. Two subgroups can be distinguished according to the homology in the N-terminal part: the two larger proteins PHO2 and PFU2 (PHO2-family ubiquitin conjugating enyzme 2) on the one hand and the two smaller ones PFU1 and PFU3 on the other. PHO2 and PFU2 were identified to be absent from the nucleus and restricted to the cytoplasm. PFU1 and PFU3 were shown to be present inside the nucleus. Only PFU1 could also be detected in the cytoplasm. Whereas PFU1 and PFU3 seem to be rather plant specific, homologues of PHO2 and PFU2 can be found throughout the whole eukaryotic kingdom, but are missing from the model organisms Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. The closest mammalian homologue is E2-230K, which is shown to display both E2 and E3 function, but its exact function in the cell is still unknown. The more distantly related homologue BRUCE has been described to be an inhibitor of apoptosis. Complete knockout mutants could be identified for PHO2, PFU1 and PFU3, whereas the PFU2 transcript is only downregulated in the T-DNA insertion line analyzed in this thesis. Mutation of either PHO2, PFU1 or PFU2 leads to suppression of cell death caused by expressing a mutated form of ubiquitin in plants. Apart from this, pfu1 and pho2 mutants show less cell death symptoms than wild type plants under ozone treatment. In contrast, the pfu2 mutant line is less sensitive to nitric oxide treatment than wild type plants. In addition, the hypersensitive response to a bacterial pathogen is delayed in the pfu1 pho2 double mutant, suggesting that both proteins are functionally interdigitated. These findings show that the PHO2 family of ubiquitin conjugating enzymes is needed to initiate programmed cell death in response to various stresses presumably by sensingreactive oxygen species or reactive nitrogen species, which highly accumulate in the cell during PCD. Further experiments with recombinant PFU1 and PHO2 protein fragments revealed that especially the C-terminal domain of the proteins is highly insoluble. Various modifications of the constructs were needed to finally obtain a soluble PHO2 fragment containing the UBC and the C-terminal domain, which can be used in future biochemical assays to test the functionality of the ubiquitin conjugating enzymes and to solve the three-dimensional structure of the highly conserved C-terminal domain.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Die PHO2-Familie von Ubiquitin-konjugierenden Enzymen in Arabidopsis thaliana und ihre Beteiligung am programmierten Zelltod in Pflanzen	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Programmierter Zelltod (PCD) ist an zahlreichen Entwicklungsvorgängen und Stressreaktionen beteiligt und daher essentiell für den Lebenszyklus einer Pflanze. Das Ubiquitin-Proteasom-System reguliert dabei eine Vielzahl zellulärer Vorgänge, die vermutlich eine Rolle in der Einleitung und Ausführung des PCD spielen. Es ist bisher allerdings nur sehr wenig über diese Ubiquitylierungsprozesse und die daran beteiligten Enzyme bekannt. Die vorliegende Arbeit bietet erste Einblicke in die biochemischen und physiologischen Eigenschaften der PHO2-Familie von ubiquitin-konjugierenden Enzymen in Arabidopsis thaliana. Dabei wird gezeigt, dass diese Enzyme bei der Reaktion auf abiotischen und biotischen Stress und dem daraus resultierenden PCD eine wichtige Rolle spielen. Die Proteinfamilie besteht aus vier Mitgliedern, die für ubiquitin-konjugierende Enzyme ungewöhnlich groß sind. Sie besitzen zusätzlich zur charakteristischen UBC-Domäne einen langen N-terminalen Bereich sowie eine weitere C-terminale Domäne, die im gesamten Pflanzenreich hochkonserviert ist. Anhand von Homologien im N-terminalen Bereich lässt sich die Familie in zwei Untergruppen einteilen: die beiden größeren Proteine PHO2 und PFU2 (PHO2-family ubiquitin conjugating enyzme 2) auf der einen und die beiden etwas kleineren Proteine PFU1 und PFU3 auf der anderen Seite. Während PHO2 und PFU2 ausschließlich im Cytoplasma lokalisiert sind, konnte eine Lokalisation für PFU3 nur im Nukleus gezeigt werden. Einzig PFU1 war in beiden Kompartimenten zu finden. Im Gegensatz zu PFU1 und PFU3, die eher pflanzenspezifisch sind, gibt es PHO2/PFU2-Homologe in einer Vielzahl weiterer eukaryotischer Organismen. Sie fehlen jedoch in den beiden Modellorganismen Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe. In Säugetieren weist E2-230K die größte Homologie zu PHO2 und PFU2 auf und besitzt in vitro sowohl E2- als auch E3-Funktion. Eine bestimmte Funktion in der Zelle konnte jedoch für dieses Protein noch nicht nachgewiesen werden. Stattdessen ist bekannt, dass BRUCE, dessen Proteinsequenz etwas weniger homolog ist, den programmierten Zelltod in Säugetierzellen inhibiert. Für PFU1, PFU3 und PHO2 konnten im Rahmen dieser Arbeit Mutanten charakterisiert werden, bei denen das jeweilige Protein komplett ausgeschaltet ist. Im Falle der pfu2-Mutante dagegen wurde gezeigt, dass das Transkript lediglich herunterreguliert ist. Die Eigenschaften dieser Mutanten wurden unter verschiedenen Wachstumsbedingungen näher untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Zelltod, der durch Expression einer mutierten Form von Ubiquitin in der Pflanze ausgelöst wird, in pho2-, pfu1- und pfu2-Mutanten stark beeinträchtigt ist. Außerdem weisen ozonbehandelte pfu1- und pho2-Mutanten im Vergleich zu Wildtyppflanzen weniger Zelltodsymptome auf. Die pfu2-Mutante dagegen ist resistenter gegenüber Stickstoffmonoxidbehandlungen als der Wildtyp. Darüber hinaus konnte für die pfu1 pho2-Doppelmutante eine verspätete Reaktion in Folge bakteriellen Pathogenbefalls beobachtet werden, was auf eine funktionelle Interaktion von PFU1 und PHO2 hindeutet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die PHO2-Familie von ubiquitin-konjugierenden Enzymen benötigt wird, um PCD in der Pflanze als Antwort auf unterschiedliche Stresssituationen einzuleiten. Die Proteine scheinen dabei auf bestimmte oxidative oder Stickstoffmonoxid-Signale zu reagieren, die sich während des PCD stark anreichern. Weitere Untersuchungen an rekombinanten PFU1- und PHO2-Proteinfragmenten ergaben, dass insbesondere die C-terminale Domäne dieser Proteine sehr unlöslich ist. Einige Modifikationen der Überexpressionkonstrukte waren nötig, um schließlich ein stark lösliches PHO2-Fragment zu erhalten. Dieses Fragement kann in künftigen Untersuchungen dazu verwendet werden, die Funktionalität der Proteinfamilie näher zu untersuchen und die dreidimensionale Struktur der hochkonservierten C-terminalen Domäne aufzuklären.

German

Creators: