Universität zu Köln

Hajheidari, Mohsen (2009). Functional analysis of CDKF;1: a plant specific CAK-activating kinase. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Cyclin-dependent protein kinases (CDKs) control checkpoint transitions of the cell cycle. Activation of CDKs requires phosphorylation of a conserved threonine residue in their T-loops by CDKactivating kinases (CAKs) that are analogously activated by CAK-activating kinases (CAKAKs). CDKF;1, a plant specific CAKAK, is reported to phosphorylate two of three known Arabidopsis CAKs (CDKD;2 and CDKD;3). Here we show that CDKF;1 and CDKDs purified from E. coli are auto-activated without cyclin binding and that CDKF;1 phosphorylates all three Arabidopsis CDKDs (CDKD;1, CDKD;2, and CDKD;3). We found that CDKF;1 and CDKD;2 are required for phosphorylation of the CTD domain of Arabidopsis RNA POLYMERASE II (RNAPII) largest subunit, which comprises of 15 consensus and 26 variant YSPTSPS tandem heptad repeats. CDKD;2 mediates Serine-5 phosphorylation of the CTD, suggesting its possible role in the control of transcription initiation and 5’ capping of nascent RNAs. CDKF;1 phosphorylates the Serine-7 residue of CTD heptapeptide repeats. Reduction of CTD-phosphorylation on Serine-7 in the cdkf;1 mutant causes overall defects in transcription and development, as well as in the production of small RNAs, including miR156, miR165, miR172, ta-siRNA1 (TAS1), and COPIA. CDKF;1 can also phosphorylate in vitro the VirD2 protein, which is covalently bound to the 5’-end of single-stranded intermediate of Agrobacterium transferred DNA (T-DNA/T-strand) and mediates its integration into the nuclear genomes of plant host cells. Previous data indicate that VirD2 interacts with the TATA-box-binding subunit of RNAPII and is phosphorylated in vivo by a CTD-associated CAK-like protein kinase. Studies of Arabidopsis CAKs show that CDKD;2 is found in association with cyclin H and CDKF;1 as part of the TFIIH complex, which is implicated in global genome and transcription-coupled repair. Our data demonstrate that mutations inactivating either CDKF;1 or its CAK substrate CDKD;2 result in dramatic reduction of tumour formation mediated by Agrobacterium tumefaciens C58. This suggests that CDKD;2 is an important mediator of VirD2 phosphorylation by CDKF;1, which is likely required for VirD2 recruitment to the TFIIH complex implicated in repair-recombination between the 5’-end of the T-strand and target sequences in the host chromosomes.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Cyclin-abhängige Protein Kinasen (CDKs) regulieren wichtige Kontrollpunkte und Übergangphase im Zellzyklus. Die Aktivierung von CDKs erfolgt durch die Phosphorylierung eines in deren T-Schleife lokalisierten, konservierten Threonin-Rests durch CDK-aktivierende Kinasen (CAKs), die ihrerseits auf analoge Weise durch CAK-aktivierende Kinasen (CAKAKs) aktiviert werden. CDKF1, eine pflanzenspezifische CAKAK, phosphoryliert Berichten zufolge zwei der drei in Arabidopsis bekannten CAKs (CDKD2 und CDKD3). Im Rahmen unserer Arbeit konnte gezeigt werden, dass in E. coli überexprimierte und aufgereinigte CDKF;1 und CDKD Kinase, ohne eine Bindung mit Cyclinen einzugehen, autoaktiviert sind und dass CDKF;1 für die Phosphorylierung aller drei Arabidopsis CDKDs (CDKD;1, CDKD;2 und CDKD;3) verantwortlich ist. Weiterhin konnten wir feststellen, dass CDKF;1 und CDKD;2 benötigt sind für die Phosphorylierung der CTD Domäne der grössten Arabidopsis RNA POLYMERASE II (RNAP II) Untereinheit, welche aus 15 konsensus und 26 variablen YSPTSPS tandem heptapeptid repeats besteht. Diesbezüglich zeigen unsere Daten, dass CDKD;2 die Phosphorylierung an der Serine-5 Position der CTD Domäne vermittelt, was auf eine mögliche Rolle von CDKD;2 in der Transkriptionsinitiation sowie dem 5’ capping naszierender RNAs schliessen läßt. Die Phosphorylierung an der Serine-7 Position der CTD Domäne hingegen wird von CDKF;1 durchgeführt. Darüber hinaus konnten wir feststellen, dass eine Verringerung der Serine-7 CTD Phosphorylierung, wie sie in der cdkf;1 Mutanten beobachtet wird, verursacht Defekte in der Transkription und während der Entwicklung, und reduziert auch die Produktion kleiner RNAs, wie miR156, miR165, miR172, ta-siRNA1 (TAS1), und COPIA. Zusätzlich konnte aufgezeigt werden, dass CDKF;1 kann auch das VirD2 Protein in vitro phosphorylieren. VirD2 ist kovalent mit dem 5’- Ende von Agrobakterium transferiert einzelsträngiger DNA (T-DNA/T-Strang) verbunden und vermittelt deren Integration in das Genom des Zellkerns der Planzenwirtszelle. Es wurde früher gezeigt, dass VirD2 mit der TATA-Box-bindenden Untereinheit (TBP) von RNAPII interagiert, und dass es in vivo von einer CTD-assoziierten CAK-ähnlichen Protein Kinase phosphoryliert wird. Andere Studien mit Arabidopsis CAKs haben gezeigt, dass CDKF;1 zusammen mit CDKD;2 und cyclin H Teil des TFIIH Komplexes sind, welcher an Genom und transkriptions-gekoppelter Exzisionsreparatur beteiligt ist. Unsere Daten zeigen, dass Mutationen verursachen die Inaktivierung von CDKF;1 oder seines CAK Substrats CDKD;2, zu einer dramatischen Verringerung der Tumorbildung durch Agrobacterium tumefaciens C58 führen. Dies läßt den Schluss zu, dass CDKD;2 ein wichtiger Vermittler der VirD2 Phosphorylierung durch CDKF;1 ist. Wir vermuten dass diese Phosphorylierung ist unerlässlich damit VirD2 mit dem TFIIH-komplex interagieren kann, der die Reparatur-Rekombination zwischen 5’-Ende des T-Stranges und der Ziel Sequenz im Wirtchromosom vermittelt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hajheidari, Mohsen hajheida@mpipz.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-41965
Date:	15 December 2009
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language miRNA, Cell Cycle, RNA polymerase II UNSPECIFIED
Date of oral exam:	1 February 2010
Referee:	Name Academic Title Hülskamp, Martin Prof. Dr
Funders:	International Max-Planck Research School
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4196