Universität zu Köln

Tosetti, Bettina (2010). Characterisation of new potential vaccine candidates against infections caused by Staphylococcus aureus. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Due to the rapid emergence of S. aureus strains resistant to multiple antibiotics and the therewith increased mortality rates, the development of alternative strategies to prevent and treat S. aureus infections is of great clinical and economical importance. Based on the results concerning both monovalent active and passive immunisation, it is getting obvious that only multivalent vaccine strategies might confer full protection from S. aureus related infections. Furthermore, due to their short term applicability and potential composition of immunoglobulins of different isotypes and functionalities, strategies based on passive immunisation are particularly advantageous. Using an intravenous immunoglobulin preparation (IVIG) as source of naturally occurring S. aureus specific IgGs, a significant inhibition of staphylococcal growth was observed in vitro. Thus, confirming the bacteriostatic effect on S. aureus as observed using human serum in the 1970s. Since this inhibitory effect was not observed upon treatment with IVIG depleted of S. aureus - specific IgGs (dSaIVIG), bacteriostasis is triggered solely by S. aureus specific IgGs. In order to analyse the underlying mechanism, gene expression profiling was conducted, using a S. aureus-seven genome PCR-product microarray. Comparison of IVIG to dSaIVIG treated samples led to the identification of 236 differentially expressed genes over the course of bacteriostasis. In contrast, IVIG compared to PBS treated samples as additional control resulted in 78 genes with altered expression. Only 13 genes were identified by both sets of microarrays, indicating a strong difference between the two applied controls. Moreover, the most prominent signature representing genes related to iron uptake and metabolism was only identified by comparison of IVIG to dSaIVIG samples. qPCR on iron related genes not only verified the microarray results, but also indicated that the iron signature was derived from dSaIVIG, thus not representing the mechanism underlying bacteriostasis. Due to the lack of a reliable signature the mechanism underlying bacteriostasis could not be characterised. Additionally, we aimed to enlarge the repertoire of potential candidates for a polyvalent vaccine. For this purpose a novel subtractive proteomic approach (SUPRA) on anchorless cell wall (ACW) proteins of S. aureus was developed. This method is based on immunodetection of in vivo expressed, immunogenic proteins separated by 2D gelelectrophoresis with either complete IVIG or dSaIVIG. Proteins immunoreactive with IVIG but not, or to a lesserextent using dSaIVIG were identified by MALDI-TOF analysis. SUPRA led to the identification of 37 new potential vaccine candidates among ACW proteins. Three of these, BT1, BT2 and BT3 were characterised in this study. The surface localisation of these antigens was confirmed by flow cytometry using specific antibodies enriched from IVIG. Purified IgGs for each antigen mediated opsonophagocytosis and subsequent opsonophagocytic killing by human neutrophils. However, when used for monovalent immunisation of BalbC mice only BT1 and BT3 conferred significant protection against lethal S. aureus challenge in a murine model of sepsis. Despite the protective potential upon monovalent immunisation a bivalent vaccination using BT1 and BT3 did not exhibit a synergistic protective effect, most likely due to the reduced amount of antigen used for immunisation. Among the six so far investigated vaccine candidates identified by SUPRA, three conferred protection against lethal challenge with S. aureus (hp2160, BT1 and BT3) and two led to a reduction of bacterial load in organs (eno and oxo). Therefore, SUPRA represents a valuable tool for the identification of promising vaccine candidates for subsequent use in a multicomponent vaccine against S. aureus.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Charakterisierung neuer Vakzinekandidaten gegen durch Staphylococcus aureus hervorgerufene Infektionen German
Translated abstract:	Abstract Language Bedingt durch die rasante Entstehung multiresistenter S. aureus (MRSA) Stämmen und der damit einhergehenden gestiegenen Mortalität, ist die Entwicklung alternativer Strategien zur Prävention und Behandlung von S. aureus Infektionen von enormer klinischer und ökonomischer Bedeutung. Basierend auf den Ergebnissen bisheriger monovalenter aktiver oder passiver Immunisierungen wird deutlich, dass eine vollständige Protektion vor S. aureus Infektionen nur durch eine Kombination von verschiedenen Antigenen erzielt werden kann. Außerdem sind, bedingt durch die kurzfristige Anwendbarkeit und die potentielle Kombination von Immunglobulinen verschiedener Isotypen und Funktionalitäten, Strategien, die auf passiver Immunisierung beruhen, besonders vorteilhaft. Unter Verwendung einer intravenösen Immunoglobulin Präparation (IVIG) als Quelle natürlich vorkommender, S. aureus spezifischer IgGs, konnte eine signifikante Inhibition des Wachstums von S. aureus beobachtet werden. Somit wurde der in den 1970er Jahren beobachtete bakteriostatische Effekt von humanem Serum auf S. aureus bestätigt. Da dieser inhibtitorische Effekt nicht beobachtet wurde, wenn S. aureus mit IVIG nach Depletion von spezifischen IgGs (dSaIVIG) kultiviert wurde, vermitteln ausschließlich S. aureus spezifische IgGs diese Bakteriostase. Um den zugrundeliegenden Mechanismus aufzuklären, wurde das Gen-Expressionsprofil mittels eines S. aureus spezifischen PCR-Produkt Mikroarrays ermittelt. Der Vergleich zwischen mit IVIG und dSaIVIG behandelten Proben führte zur Identifikation von 236 differentiell exprimierten Genen im Verlauf des bakteriostatischen Effektes. Im Gegensatz dazu ergab der Vergleich von IVIG zu mit PBS kultivierten Staphylokokken als zusätzliche Kontrolle nur 78 Gene mit veränderter Expression. Nur 13 Gene wurden durch beide Mikroarray Analysen identifiziert. Darüber hinaus wurde die auffälligste Signatur von insgesamt 36 Genen, die in in Verbindung mit dem Transport und Metabolismus von Eisen stehen, nur durch den Vergleich von IVIG mit dSaIVIG identifiziert. Mittels qPCR dieser Gene wurden nicht nur die Mikroarray Daten verifiziert, sondern zudem gezeigt, dass die Eisen Signatur durch dSaIVIG eingebracht wurde und daher nicht den Mechanismus drastellen, der der Bakteriostase zugrundeliegt. Da die weitere Analyse nicht zur Identifikation einer zuverlässigen Signatur geführt hat, konnte der zu Bakteriostasis führende Mechanismus nicht aufgeklärt werden. Außerdem wollten wir das Repertoire geeigneter Antigene für die Verwendung in einer polyvalenten Vakzine gegen S. aureus erweitern. Zu diesem Zweck wurde eine neue subtraktive Proteom Analyse (SUPRA) von Zellwand-assoziierten Proteinen von S. aureus entwickelt. Diese Methode basiert auf der Immunodetektion von mittels 2D Gelelektrophorese aufgetrennten, in vivo exprimierten immunogenen Proteinen mit IVIG oder dSaIVIG. Proteine die mit IVIG, aber nicht oder deutlich geringer mit dSaIVIG detektiert wurden, wurden mittels MALDI-TOF Analyse identifiziert. SUPRA führte zur Identifikation von 37 neuen potentiellen Vakzinekandidaten in der Gruppe der Zellwand-assoziierten Proteine. Drei dieser Kandidaten, BT1, BT2 und BT3 wurden in dieser Arbeit charakterisiert. Mittels aus IVIG aufgereinigten spezifischen IgGs konnte die Oberflächenlokalisation der drei Proteine mittels Durchflusszytometrie bestätigt werden. Außerdem vermittelten diese Antikörper Opsonophagozytose und anschliessende Elimination durch humane Neutrophile. Nach monovalenter Immunisierung von BalbC Mäusen führten jedoch lediglich BT1 und BT3 zu einer Protektion vor letaler intravenöser Infektion mit S. aureus. Eine bivalente Immunisierung mit BT1 und BT3 führte allerdings im Vergleich zur Einzelimmunisierung nicht zu einem synergistischen protektiven Effekt, sehr wahrscheinlich bedingt durch die reduzierte Antigenmenge während der Immunisierung. Von den bisher insgesamt sechs getesteten, durch SUPRA identifizierten Vakzine Kandidaten, vermittelten drei Protektion vor letaler Infektion mit S. aureus (hp2160, BT1 und BT3) und zwei führten zu einer reduzierten Bakterienlast in Organen (eno und oxo). Daher bietet SUPRA eine wertvolle Methode zur Identifikation vielversprechender Kandidaten für die Verwendung in einer polyvalenten Immunisierung. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Tosetti, Bettina bettina.tosetti@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-42308
Date:	2010
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene > Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language S. aureus, vaccine, immunoglobulins, IVIG English S. aureus, Vakzine, Immunglobuline, IVIG UNSPECIFIED
Date of oral exam:	12 July 2010
Referee:	Name Academic Title Krönke, Martin Prof. Dr. Howard, Jonathan C. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4230