Untersuchungen zur Rolle von Transkripten unbekannter Funktion für die Kardiomyogenese und Funktion von Kardiomyozyten im Zebrafisch (Danio rerio) und in murinen embryonalen Stammzellen

Niemann, Rabea (2011). Untersuchungen zur Rolle von Transkripten unbekannter Funktion für die Kardiomyogenese und Funktion von Kardiomyozyten im Zebrafisch (Danio rerio) und in murinen embryonalen Stammzellen. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Zusammenfassung Herz-Kreislauferkrankungen sind eine der haeufigsten Todesursachen in Europa. Ein durch den Verlust von funktionalen Kardiomyozyten hervorgerufener Herzfehler ist am weit verbreitetsten. Daher ist es ein erster Schritt, in Hinblick auf zukuenftige Therapiemoeglichkeiten, das genetische Netzwerk zu verstehen, das zu funktionalen Kardiomyozyten fuehrt. Viele Fragen hinsichtlich beteiligter Gene und molekularer Signalwege bleiben derzeit aber noch offen. Daher ist eine Untersuchung von Transkripten unbekannter Funktion und ihre Rolle für die Kardiogenese von großem Interesse. Durch eine großangelegte Expressionsstudie mit Affymetrix Expressionsmikroarrays in der Arbeitsgruppe wurde das komplette Transkriptom von reinen mesodermalen Zellen und Kardiomyozyten ermittelt (Doss et al., 2007a+b). Aus diesen Analysen konnten wir zwei Gene A130092J06Rik und Zfp533 identifizieren, die spezifisch in den Kardiomyozyten hochreguliert waren. Ebenso wurden zwei Gene 9530057J20Rik und Ddit4l identifiziert, die in mesodermalen Zellen und Kardiomyozyten hochreguliert waren. Weitere zwei Gene 4930506M07Rik und Zfp365 wurden identifiziert, die in mesodermalen Zellen hochreguliert, aber in Kardiomyozyten runterreguliert waren. Als Vergleich dienten jeweils undifferenzierte ES-Zellen und Kontoll-EBs. Um eine erste funktionale Charakterisierung dieser Gene für eine intakte Herzentwicklung zu erhalten, wurden durch Injektion von Morpholino-modifizierten Oligonukleotiden knockdown-Studien im Zebrafisch durchgefuehrt. knockdown von 4930506M07Rik, A130092J06Rik und Zfp533 fuehrte zu Herzdefekten. Ebenso wurde das Differenzierungspotential der Gene in murinen ES-Zellen untersucht. Hierzu wurde mit Hilfe der short hairpin RNA (shRNA) Methode die Genexpression inhibiert. Besonders für A130092J06Rik konnte eine wichtige Rolle für die Differenzierung von ES-Zellen zu frühen mesodermalen Zellen und intakten Kardiomyozyten dargelegt werden. Für Zfp533 konnte zudem ein Einfluss auf die Haematopoiese und vaskulaere Entwicklung nachgewiesen werden. Mittels PCR, Immunohistochemie und Mikroarrayanalysen wurde gezeigt, dass der knockdown der beiden Gene die Expression spezifischer mesodermaler und kardialer Marker signifikant reduzierte. Die vorliegenden Resultate zeigen, dass die beiden, spezifisch in Kardiomyozyten hochregulierten, Gene A130092J06Rik und Zfp533 eine entscheidende Rolle für die Kardiomyogenese spielen.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Abstract Heart failure due to the loss of functional cardiomyocytes is one of the most frequent cardiovascular diseases. Understanding the genetic network that leads to functional cardiomyocytes is the first step to develop future therapies. Two murine engineerd mesodermal ESC lines as well as a cardiac-specific ESC line were established in our group. A global transcriptome analysis yielded two genes A130092J06Rik and Zfp533 up-regulated in cardiomyocytes, two genes 9530057J20Rik and Ddit4l up-regulated in cardiomyocytes and pure mesodermal cells and two genes 4930506M07Rik and Zfp365 up-regulated in pure mesodermal, but down-regulated in cardiomyocytes (Doss et al., 2007a+b). We were interested in a fast screen for the functional role of transcripts with unknown function (TUFs) for an intact activity of the heart. Therefore we searched for homologues in the zebrafish genome and performed a morpholino-based knockdown approach. Morpholino-oligonucleotide injections of 4930506M07Rik, A130092J06Rik und Zfp533 caused highly specific cardiovascular defects in the majority of them such as altering of heart morphology and defects to a different extent and penetrance. For knockdown of the gene expression in murine ESCs to further analyze the potential for cellular differentiation, short hairpin RNA (shRNA) was used. PCR, Immunohistochemistry and microarray analysis indicated that the knockdown of A130092J06Rik and Zfp533 suppresses the expression of specific mesodermal and cardiac marker genes significantly. The present results demonstrate that, the in cardiomyocytes specifically up-regulated, genes A130092J06Rik and Zfp533 play a crucial role in cardiomyogenesis.

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