Analysis of the modifying influence of Plastin 3 (PLS3) on Spinal Muscular Atrophy (SMA) by generation of transgenic mouse models

Ackermann, Bastian (2011). Analysis of the modifying influence of Plastin 3 (PLS3) on Spinal Muscular Atrophy (SMA) by generation of transgenic mouse models. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Spinal muscular atrophy (SMA) is a neurodegenerative disease characterized by the loss of α-motor neurons in the ventral horn of the spinal cord. Depending on the severity, the clinical spectrum of SMA ranges from early infant death to normal adult life with only mild muscle weakness. To date, no cure is available. SMA is caused by the homozygous loss of the survival motor neuron gene 1 (SMN1). Besides SMN1, another nearly identical copy of the gene is present in the human genome, thus called SMN2. In the SMN2 gene, a C to T transition in exon 7 leads to the disruption of an exonic splicing enhancer, resulting in alternative splicing of SMN2 pre-mRNA and skipping of exon 7 in 90 % of total transcript. However, about 10 % of full length (FL) transcripts are still being produced by SMN2. Through gene duplication events, SMN2 is present in varying copy numbers in the human population, ranging from the total absence to a maximum of 4 SMN2 copies per allele. Since every copy produces about 10 % FL transcript, SMA severity is inversely correlated with SMN2 copy number. For a long time, SMN2 was the only known modifying gene and has therefore been target for the development of therapeutic strategies. The observation of SMN1-deleted patients with either extremely weakened or even absent symptoms in the presence of only a small number of SMN2 copies has in the past been associated with the existence of SMA-modifying genes. Finally, in 2008 the Actin-bundling protein Plastin 3 (PLS3) has been identified as a protective modifying gene showing high expression in asymptomatic homozygously SMN1- deleted siblings of discordant SMA families in our group (Oprea et al., 2008). Cell culture as well as in vivo experiments in a zebrafish SMA model revealed that PLS3 overexpression rescues the axonal outgrowth phenotype. The goal of the present study was to address the question whether PLS3 overexpression is able to rescue the phenotype in an existing SMA mouse model. Furthermore, it was asked which effect PLS3 overexpression has on the development of neuromuscular junctions (NMJ) as well as muscle development and function. Using the Cre/loxP system, transgenic mice were generated expressing a V5-tagged version of human PLS3 (PLS3V5) either ubiquitously or motor neuron specifically (Hb9 promoter). In a next step, PLS3V5 transgenic mice were crossed onto the SMA background using the Hung mouse model. All mice were crossed congenic onto clean C57BL/6N background to exclude any background modifying effects. Transgenic PLS3V5 mice on wildtype (wt) as well as on SMA background were histologically (Motor neurons, NMJs, muscle) and functionally (Motoric tests, weight, survival) analyzed in detail. Ubiquitous as well as motor neuron specific PLS3V5 expression was proven by qRT-PCR, Western blot analysis and immunohistochemistry. PLS3V5 transgenic mice on wt as well as on SMA background showed remarkable influence of PLS3 overexpression on motor neuron and NMJ phenotype: The motor neuron and Acetylcholine receptor (AChR) cluster size was highly increased as compared to wt or SMA littermates. Time course measurements of presynaptic sprouting during the process of axonal pruning revealed highly improved axonal connectivity. These findings raised the question whether the increase of AChR cluster size in transgenic animals is an effect of pre- or postsynaptic PLS3V5 overexpression. To address this issue, motor neuron specific PLS3V5 overexpression was analyzed in wt mice. Strikingly, motor neuron specific overexpression of PLS3V5 was sufficient to increase AChR cluster and muscle fiber size, further strengthening the positive impact of neuronal PLS3V5 expression on neurotransmission. Moreover, electrophysiological analyzes (NMJ quantal content measurements, Motor Unit Number Estimate (MUNE)) will be performed in the future and correlated with the recent findings. Despite this positive impact on axon biology, PLS3 overexpression neither increased survival nor improved motoric ability in the severe type I-like SMA mouse model used in this study. Therefore, it was hypothesized that a certain amount of SMN is required – similar to asymptomatic humans, who own at least 3 SMN2 copies – to rescue the SMA phenotype. To test this hypothesis, the PLS3V5 transgene is currently crossed onto a milder SMA background. Additionally, PLS3V5 was up to now only heterozygously overexpressed in SMA mice. Since also higher PLS3V5 levels might be necessary to finally improve SMA symptoms, PLS3V5 will be homozygously expressed in the SMA background in the future.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Analyse des modifizierenden Einflusses von Plastin 3 (PLS3) auf den Schweregrad der Spinalen Muskelatrophie (SMA) durch die Generierung von transgenen Mausmodellen	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Die spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine neurodegenerative Erkrankung und kennzeichnet sich durch den Verlust der α-Motoneurone in den ventralen Hörnern des Rückenmarks aus. Abhängig vom Schweregrad der SMA, für die es derzeit noch keine Heilmethode gibt, reicht das klinische Erscheinungsbild vom frühkindlichen Tod bis zu einer normalen Lebenserwartung in Begleitung einer milden Form der Muskelschwäche. SMA wird durch den homozygoten Verlust des survival motor neuron Gens 1 (SMN1) verursacht. Neben SMN1 existiert beim Menschen noch ein weiteres, sehr ähnliches Gen: SMN2. Das SMN2 Gen besitzt eine C zu T Nukleotidtransition in Exon 7. Durch die Transition wird ein exonischer Spleißverstärker (engl. exonic splicing enhancer (ESE)) in seiner Sequenz verändert, was zu alternativem Spleißen der SMN2 prä-mRNA und Verlust von Exon 7 in 90 % der Gesamttranskriptmenge führt. Dennoch produziert auch SMN2 noch rund 10 % Vollängetranskripte. Durch Genkonversion bedingt, kommt SMN2 in der menschlichen Population in unterschiedlicher Kopienzahl vor, wobei die Anzahl zwischen null und maximal vier Kopien pro Allel schwanken kann. Da von SMN2 noch rund 10 % Volllängetranskripte gebildet werden, korreliert der Schweregrad der Erkrankung invers mit der Anzahl vorhandener SMN2 Kopien. Eine lange Zeit war SMN2 das einzige bekannte SMA-modifizierende Gen und daher Ziel zahlreicher Therapieansätze. Interessanterweise jedoch wurden in der Vergangenheit immer wieder SMN1-deletierte Patienten beschrieben, die trotz geringer SMN2 Kopienzahl eine nur sehr schwache bis gar nicht ausgeprägte Symptomatik zeigen. Diese Beobachtungen wurden auf das Vorhandensein anderer modifizierender Faktoren in nichtbetroffenen Patienten solcher sogenannten diskordanten Familien zurückgeführt. Im Jahr 2008 wurde in unserer Arbeitsgruppe schließlich das Aktinfilament bündelnde Protein Plastin 3 (PLS3) als stark hochreguliert und vor SMA schützend in asymptomatischen SMN1 homozygot deletierten Geschwistern diskordanter Familien identifiziert (Oprea et al., 2008). An neuronalen Zellkulturen und in einem Zabrafisch-SMA Modell wurde gezeigt, dass PLS3-Überexpression Defekte im axonalen Auswachsen kompensieren kann. Im Sinne eines klassischen Rettungsexperiments war das Ziel der hier vorgelegten Arbeit die Untersuchung der Frage, ob die PLS3-Überexpression zu deutlicher Verbesserung der SMA-Symptomatik in einem bestehenden SMA-Mausmodell (Hung SMA Mäuse) führt. Weiterhin wurde untersucht, welchen Einfluss die PLS3-Überexpression auf die Entwicklung der neuromuskulären Endplatte (NME) sowie der Muskulatur und deren Funktion hat. Zur Beantwortung dieser Fragen wurden Im Rahmen dieser Arbeit unter Zuhilfenahme des Cre/loxP Systems transgene Mäuse hergestellt, die eine V5-markierte Version des humanen PLS3 entweder Motoneuronen-spezifisch (Hb9 Promotor), oder ubiquitär exprimieren. Im nächsten Schritt wurde das PLS3V5-Transgen dann auf den SMA Hintergrund des Hung Mausmodells gekreuzt. Um modifizierende Einflüsse des genetischen Hintergrunds auszuschließen, wurden alle Mäuse durch Rückkreuzung über mindestens 7 Generationen auf einen reinen C57BL/6N-Hintergrund gebracht. Transgene PLS3V5-Mäuse auf wt und SMA Hintergrund wurden dann histologisch (Motoneuronen, NME, Muskel) und funktional (Motorische Tests, Gewichtsmessung, Überlebensdauer) detailliert analysiert. Zunächst wurde die Motoneuronen-spezifische sowie ubiquitäre PLS3V5-Expression mittels quantitativer reverser Trankskription (qRT) PCR, Western blot Analyse sowie Immunohistochemie bestätigt. Bei der anschließenden Untersuchung PLS3V5 transgener Mäuse auf wt und SMA Hintergrund wurde ein signifikanter Einfluss der PLS3 Überexpression auf den Motoneuronen und NME Phänotyp festgestellt: Im Vergleich zu wt oder SMA Kontrolltieren waren Motoneurone und Acetylcholinrezeptoren (AChR) Cluster stark vergrößert. Die Untersuchung präsynaptischer Verästelungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der axonalen Spezifizierung ergab eine stark verbesserte axonale Verknüpfung in PLS3V5 exprimierenden Tieren. Diese Ergebnisse ließen die Frage aufkommen, ob die beobachtete Vergrößerung der AChR Cluster auf prä- oder postsynaptische Effekte der PLS3V5 Expression zurückzuführen sei. Um diese Frage zu beantworten, wurde PLS3V5 im folgenden motoneuronenspezifisch im wt Hintergrund überexprimiert und die AChR Cluster Größe bestimmt. Dabei konnte festgestellt werden, dass die motoneuronenspezifische Überexpression von PLS3V5 ausreichend für die Vergrößerung der AChR Cluster ist. Darüber hinaus konnte in solchen Tieren sogar eine signifikante Zunahme des Muskelfibrillen-Durchmessers festgestellt werden. Diese Beobachtungen scheinen einen positiven Effekt der PLS3V5-Überexpression auf die neuronale Weiterleitung zu bestätigen. Dennoch müssen weitere elektrophysiologische Untersuchungen (z.B. Bestimmung des „quantal content“, Motor Unit Number Estimate (MUNE)) durchgeführt werden, um ein detaillierteres Bild der Auswirkungen einer PLS3V5-Überexpression auf die Reizweiterleitung zu gewinnen. Trotz der genannten positiven Effekte auf die axonale Entwicklung konnte in PLS3V5 exprimierenden SMA Tieren weder eine verlängerte Lebenszeit, noch eine verbesserte Motorik beobachtet werden. Darum wurde die Hypothese aufgestellt, dass PLS3V5 möglicherweise nur in Gegenwart einer gewissen SMN Menge den SMA-Phänotyp verbessern oder retten kann, ähnlich der Situation in asymptomatischen Menschen, die immer mindestens 3 SMN2 Kopien trugen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wird das PLS3V5-Transgen derzeit bereits auf einen milderen SMA-Hintergrund gebracht. Außer einer nicht ausreichenden SMN Menge könnte auch eine zu niedrige PLS3V5-Konzentration für das Ausbleiben von krankheitsverbessernden Effekten sein. Da in allen bisherigen Versuchen PLS3V5 lediglich heterozygot überexprimiert wurde, werden aktuell Verpaarungen zur homozygoten Überexpression von PLS3V5 auf dem SMA Hintergrund durchgeführt.

German

Creators:

Creators	Email	ORCID	ORCID Put Code
Ackermann, Bastian	bas.ackermann@gmx.de	UNSPECIFIED	UNSPECIFIED

Corporate Contributors:

Institut für Humangenetik, Universität zu Köln, Institut für Genetik, Universität zu Köln, Centre for Molecular Medicine Cologne (CMMC), Universität zu Köln

URN:

urn:nbn:de:hbz:38-44476

Date:

21 November 2011

Language:

English

Faculty:

Faculty of Mathematics and Natural Sciences

Divisions:

Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics

Subjects:

Life sciences
Medical sciences Medicine