Universität zu Köln

Vierkotten, Sarah (2011). HTRA1: Ein Kandidatengen für die Altersbedingte Makuladegeneration? PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Polymorphismen in der chromosomalen Region 10q26 sind stark mit einem erhöhten Erkrankungsrisiko der Altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) assoziiert. In diesem Bereich liegt das Gen high temperature requirement protein A1 (HTRA1). Das Gen kodiert eine Serinprotease, die vor allem in der Qualitätskontrolle von Extrazellulärmatrix (EZM)-Proteinen eine Rolle spielt. Der single nucleotide polymorphism (SNP) rs11200638 im Promotor des HTRA1-Gens verursacht eine Überexpression von HTRA1 im retinalen Pigmentepithel (RPE) und erhöht das Erkrankungsrisiko der AMD deutlich. In AMD-Patienten wurde eine zwei- bis dreifache Überexpression an HTRA1-Protein in RPE-Zellen nachgewiesen. Bislang gab es jedoch keine funktionellen Studien zur Überexpression von HTRA1 im RPE, die Aufschluss über die Beteiligung von HTRA1 an der Entstehung der AMD geben könnten. In dieser Arbeit wurde die Rolle der HTRA1-Überexpression in der Pathogenese der AMD untersucht. Dazu wurden transgene Mäuse generiert, die HTRA1-Protein im RPE 2,7-fach überexprimierten. Die Htra1-transgenen Mäuse entwickelten keine spontane choroidale Neovaskularisation (CNV) in der Retina. Die CNV-Induktion mittels Laserkoagulation ließ in der Fluoreszenz-Angiographie (FAG), der spektralen optischen Kohärenztomographie (SD-OCT) und histologischen Untersuchungen nicht auf eine erhöhte Angiogenese durch die HTRA1-Überexpression schließen. Ebenfalls besaßen Htra1-transgene Mäuse im Vergleich zum Wildtypen keine Expressionsunterschiede vom transformierenden Wachstumsfaktor-beta (TGF-ß), vom Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors-1 (IGF-1) und vom vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) im Auge. Unterdessen zeigte sich in Zellkulturüberständen Htra1-transfizierter Nierenzellen (HEK-293-EBNA) eine reduzierte Konzentration von VEGF, Endostatin und Angiogenin im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen und Kontrollen. Die Konzentration von Angiopoietin-1 war dagegen leicht erhöht. Anhand von Transmissonselektronenmikroskopie (TEM)-Bildern war eine Fragmentierung der elastischen Schicht (EL) der Bruchschen Membran (BrM) in Htra1-transgenen Mäusen zu beobachten. Zusätzlich kam es zu verminderten Expressionen von Fibulin-5 und Tropoelastin (TE) in Protein-Lysaten von RPE, BrM und Choroidea. Versuche mit rekombinantem HTRA1 bestätigten weiterhin den Abbau von Fibulin-5 durch HTRA1. Diese Daten deuten auf eine gestörte Elastogenese in der BrM von Htra1-transgenen Mäusen hin. Interessanterweise sind Mutationen im FBLN5 (Fibulin-5)-Gen, die zu einer reduzierten Sekretion von Fibulin-5 führen, mit der AMD assoziiert. Darüber hinaus war die Stabilität der BrM weiterhin durch den HTRA1-bedingten Abbau von Fibronektin gestört. So war die Expression von Fibronektin und Fibronektin-Fragmenten in den transgenen Mäusen erhöht und die Adhäsion Htra1-transfizierter Nieren- und RPE (ARPE-19)-Zellen an Fibronektin deutlich reduziert. Zudem wurden Fibronektin und Nidogen-1 und -2, aber nicht Laminin-1 und Kollagen IV von rekombinantem HTRA1-Protein proteolytisch gespalten. Die Immunfluoreszenzfärbungen auf Paraffinschnitten der Retinae Htra1-transgener und Wildtyp-Mäuse ließen allerdings keine Änderungen in der Farbintensität oder Verteilung von Nidogen-1 und -2 und auch Laminin-1 und Kollagen IV erkennen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die BrM eine wichtige Rolle bei der Entstehung der AMD hat. Eine HTRA1-Überexpression führt durch die Reduktion von Fibulin-5 und TE zu einer gestörten Elastogenese in der EL der BrM. Auf Grund dieser Ergebnisse kann HTRA1 auch mit anderen AMD-Risikogenen wie MMP-9 (Matrixmetalloproteinase-9), TIMP-3 (Gewebeinhibitor von Metalloptroteinasen-3) und FBLN-3, -5 und -6 in Verbindung gebracht werden.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Variants in the chromosomal region 10q26 are strongly associated with an increased risk for age-related macular degeneration (AMD). The high-temperature requirement protein A1 (HTRA1) gene is located in this region. The gene encodes for a serine protease, which is implicated in the quality control of extracellular matrix (ECM) proteins. Previous studies have suggested that the single nucleotide polymorphism (SNP) rs11200638 in the promotor region of HTRA1 results in overexpression of HTRA1 protein and contributes to AMD pathology. A two to threefold overexpression of HTRA1 has been found in retinal pigment epithelium (RPE) cells of AMD patients. To date, there is no functional evidence of HTRA1 involvement in the disease. This study investigated the role of HTRA1 overexpression in the pathogenesis of AMD. Transgenic Htra1 mice overexpressing the murine protein in the retinal pigment epithelium (RPE) 2,7 fold were generated. These mice showed no signs of spontaneous choroidal neovascularization (CNV) development. CNV induction via laser coagulation did not display an increased angiogenesis in Htra1 overexpressing mice when analyzed via fluorescence angiography (FAG), spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and histology. No differences in expression of transforming growth factor-beta (TGF-ß), insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) could be observed in the eye, while cell culture supernatants of Htra1 transfected kidney cells revealed lower concentrations of VEGF, endostatin and angiogenin when compared to untransfected cells and controls. A higher concentration could be observed for angiopoietin 1. Transmission electron microscopy images demonstrated the fragmentation of the elastic layer (EL) of Bruch’s membrane (BrM) in Htra1 transgenic mice. Subsequent Western Blot analysis revealed a reduction of fibulin 5 and tropoelastin (TE) in the RPE/BrM/Choroid layers. Furthermore, cleavage of fibulin 5 by recombinant HTRA1 lacking the N-terminal domain could be demonstrated. Fibulin 5 is essential for elastogenesis by promoting elastic fiber assembly and maturation. Therefore, the data implicate that HTRA1 overexpression leads to an altered elastogenesis in BrM through fibulin 5 cleavage. Intriguingly, mutations in the FBLN5 (fibulin 5) gene, which result in a reduced secretion of fibulin 5 are associated with AMD. The integrity of BrM is further compromised through HTRA1 cleavage of fibronectin. The expression of fibronectin and fibronectin fragments was increased in the RPE/BrM/Choroid layers of Htra1 transgenic mice and the adhesion properties of Htra1 transfected RPE cells to fibronectin were significantly reduced. Recombinant HTRA1 cleaved fibronectin, nidogen 1 and nidogen 2 but not laminin 1 and collagen IV. Meanwhile, no differences in staining intensities and distribution were observed for nidogen 1 and nidogen 2 via immunofluorescence staining of retina sections. Taken together, the data hint to an important function of BrM in the development of AMD. HTRA1 overexpression leads to an altered elastogenesis in the EL of BrM through a reduction of fibulin 5 and TE. It highlights the importance of ECM related proteins in the development of AMD and links HTRA1 to other AMD risk genes such as MMP9 (matrix metalloproteinase 9), TIMP3 (tissue inhibitor of metalloproteinases 3) as well as FBLN3, 5 and 6. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Vierkotten, Sarah sarah_vierkotten@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Creators:	Universität zu Köln, Medizinische Fakultät, Zentrum für Augenheilkunde
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-44832
Date:	6 September 2011
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Subjects:	Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Altersbedingte Makuladegeneration German extrazelluläre Matrix German
Date of oral exam:	11 November 2011
Referee:	Name Academic Title Paulsson, Mats Prof. Dr. Korsching, Sigrun Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4483