Universität zu Köln

Neacsu, Cristian Dan (2011). Untersuchungen zur Funktion der Knorpelproteine Ucma und Matrilin-1 im Zebrafisch. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

UCMA (im Zebrafisch Ucma) und Matrilin-1 sind zwei „nicht kollagene“ Proteine der Extrazellulärmatrix des Knorpels, deren Funktion bisher nur unzureichend aufgeklärt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zebrafisch als Modellorganismus herangezogen um Expression und Funktion beider Proteine während der Zebrafisch Embryonalentwicklung zu untersuchen. UCMA, auch GRP genannt, ist ein vor kurzem entdecktes Mitglied der Familie der Glutamat γ-carboxylierten Proteine und wird hauptsächlich im Knorpel exprimiert. Im Zebrafisch sind aufgrund einer zusätzlichen Genomduplikation zwei Kopien des UCMA Gens vorhanden, ucmaa und ucmab, die sich jeweils auf den Chromosomen 25 und 4 befinden. Genstruktur, alternatives Spleißen und Proteinsequenz von UCMA sind zwischen Säugetieren und Zebrafisch stark konserviert und beide Formen von Zebrafisch Ucma sind in skelettalen Geweben exprimiert. Ucmaa wurde ab 18 hpf im sich entwickelnden Notochord detektiert. Außerdem wurde es in den sich entwickelnden Kraniofazialknorpeln gefunden. Ucmab Expression hingegen konnte nur schwach in spezifischen Knorpeln des Kraniofazialskeletts, jedoch nicht im Notochord und erst ab 96 hpf detektiert werden. Der „knockdown“ von Ucmaa führt zu schweren Wachstumsdefekten und Störungen der Skelettbildung. Im Knorpel von Morphanten findet sich weniger Aggrecan und Kollagen II. Vergleichbare Defekte konnten nach Unterdrückung der Glutamat γ-Carboxylierung durch Warfarin beobachtet werden, ein Hinweis darauf, dass die posttranslationale Modifikation essentiell für die Funktion von Ucmaa ist und die fehlende Glutamat γ-Carboxylierung an der Entstehung der sogenannten „Warfarin Embryopathien“ und ähnlichen skelettalen Krankheiten des Menschen beteiligt sein kann. Matrilin-1 ist das prototypische Mitglied der Familie der Matriline und in Mensch und Maus hauptsächlich in Knorpel exprimiert. Matn-1 weist während der Entwicklung des Zebrafisches eine mehrphasige Expression auf. Während der frühen Expression, die bei ca. 15 hpf ihren Höhepunkt erreicht, ist Matn-1 im ganzen Zebrafischembryo mit Ausnahme des Notochords exprimiert. Während der späten Expression, die ab etwa 64 hpf beginnt, kann Matn-1 hauptsächlich im Knorpel detektiert werden. Der „knockdown“ von Matn-1 führt, ähnlich wie jener von Ucmaa, sowohl zu Wachstumsdefekten und Störungen bei der Bildung der Kraniofazialknorpel, als auch zum Verlust von Aggrecan und Kollagen II. Der Verlust von Matn-1 hat während der frühen und der späten Expression unterschiedliche Auswirkungen. In der frühen Expressionsphase ändert sich die Zellmorphologie nicht, jedoch können ER-Stress und Apoptose nachgewiesen werden. Während der zweiten Expressionsphase führt der Verlust von Matn-1 zu ausgeprägten morphologischen Veränderungen des endoplasmatischen Retikulums von Chondrozyten. Anzeichen für ER-Stress gibt es nicht, dagegen kann Autophagie nachgewiesen werden. Ein weiterer Hinweis auf eine Störung von Synthese und Sekretion durch den „knockdown“ von Matn-1 ergibt sich aus der Behandlung von Matn-1 Morphanten mit dem Proteasominhibitor Bortezomib. Diese Behandlung erhöhte die Phänotypenrate signifikant, so dass anzunehmen ist, dass die betroffenen Zellen in begrenztem Umfang in der Lage sind den Matn-1 „knockdown“ mit einem erhöhten Proteinabbau zu kompensieren.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language UCMA and Matrilin-1 are two non collagenous proteins of the cartilage extracellular matrix whose functions have not yet been fully elucidated. In this study, the zebrafish was used as a model organism to investigate the expression and function of the two proteins during zebrafish embryonic development. UCMA, alternatively named GRP, is a recently discovered member of the family of the glutamate γ-carboxylated proteins and mainly expressed in cartilage. In zebrafish two copies of the UCMA gene are present due to an additional genome duplication, ucmaa and ucmab, which are located on chromosomes 25 and 4 respectively. Gene structure, alternative splicing and protein sequence of UCMA are strongly conserved between mammals and zebrafish, and both forms of zebrafish UCMA are expressed in skeletal tissues. Ucmaa expression was detected from 18 hpf on in the developing notochord. It was also found in the developing craniofacial cartilage. Ucmab expression, however, could only be weakly detected in specific parts of the craniofacial cartilage, but not in the notochord and only from 96 hpf on. The knockdown of Ucmaa leads to severe growth defects and disruption of skeletal formation and the cartilage of Ucmaa morphants contains decreased amounts of collagen II and aggrecan. Comparable defects could be observed after suppression of glutamate γ-carboxylation by warfarin, an indication that posttranslational modification is essential for the function of Ucmaa and that the lack of glutamate γ-carboxylation is involved in the etiology of "warfarin embryopathies" and similar skeletal diseases in humans. Matrilin-1 is the prototypical member of the matrilin protein family. In human and mouse it is mainly expressed in cartilage. Matn-1 shows a multiphasic expression during zebrafish development. During the early expression phase, which peaks at about 15 hpf, Matn-1 is present throughout the zebrafish embryo with exception of the notochord. During the late phase, which begins around 64 hpf, Matn-1 is detected mainly in cartilage. The "knock down" of Matn-1 results, similar to that of Ucmaa, in both growth defects and disturbances in the formation of the craniofacial cartilage, as well as the loss of aggrecan and collagen II. The lack of Matn-1 has different effects on the development of the zebrafish during the early and the late expression phases. The knockdown during the early phase has no effects on cell morphology, although ER stress and apoptosis can be detected. During the second phase, the loss of Matn-1 leads to pronounced morphological changes of the ER of chondrocytes. ER stress does not occur, but autophagy can be detected. Another indication that protein synthesis and secretion is disturbed by the knockdown of Matn-1 was obtained by the treatment of Matn-1 morphants with the proteasome inhibitor Bortezomib. This significantly increases the phenotype frequency, suggesting that the affected cells are able to partially compensate for the loss of Matn-1 by increased protein degradation. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Neacsu, Cristian Dan cneacsu@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Contributors:	Institut für Biochemie II der Medizinischen Fakultät
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-44996
Date:	October 2011
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Ehemalige Fakultäten, Institute, Seminare > Faculty of Mathematics and Natural Sciences > no entry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language UCMA, matrilin-1, zebrafish, cartilage English
Date of oral exam:	10 November 2011
Referee:	Name Academic Title Paulsson, Mats Prof. Dr. med. Hammerschmidt, Matthias Prof. Dr. rer. nat.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4499