Universität zu Köln

Maier, Alexander (2011). Genetic and Biochemical Characterization of COP1/SPA Funktion in Arabidopsis Photomorphogenesis. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Plants as sessile organisms are dependent on a complex interaction with their environment. Light is one of the most important factors that affect multiple stages of plant growth and development. In concert with the four SPA proteins (SPA1-SPA4) the E3-ubiquitin ligase COP1 acts as a repressor of light signaling in darkness. COP1 and SPA proteins were also found to regulate processes like Determination of leaf size, stomata differentiation and Induktion of photoperiodic flowering. In this regard, COP1 targets transcription factors like HY5, HFR1 or CO for ubiquitination and subsequent 26S proteasome-dependent degradation. Furthermore, SPA proteins physically interact with the COP1 protein. In the present study I could show that SPA proteins can interact with each other in vitro and in planta, building homo- and heterodimers. This indicates the existence of larger COP1/SPA containing complexes in which every combination of SPA dimers is possible. Further, I could show that the N-terminus including the proteins’ coiled-coil domain mediates the interactions within the SPAs. Since SPA proteins carry out overlapping but also distinct functions throughout plant development and this cannot be solely explained by their mRNA and Protein expression patterns, there must be other mechanisms regulating COP1/SPA complex assembly and/or activity. Using antibodies against native SPA1 and SPA2 protein generated in this study, I could show that SPA1 and SPA2 Protein levels decrease in far-red light compared to darkness, whereas transcript levels remained unchanged, pointing to a post-translational mechanism regulating SPA Funktion. However, whether this is dependent on COP1 needs to be verified. COP1/SPA complexes most likely are involved in a broad spectrum of developmental processes. Thus, I analyzed the regulation of two new potential targets, PAP1 and PAP2, which are transcription factors involved in the regulation of light-dependent anthocyanin biosynthesis. I could show that PAP1 and PAP2 interact with the members of COP1/SPA complexes in yeast. Further, I could show that PAP1 and PAP2 proteins from overexpressing plants are stabilized by light and accumulate upon treatment with the proteasomal blocker MG132, indicating a post-translational regulation of PAP protein abundance. Analysis of RNAi mutants and PAP overexpressing plants in cop1-4 background revealed an effect of the cop1 Mutation on PAP-dependent anthocyanin biosynthesis. Furthermore, an initial Experiment showed, that PAP2 protein in 35S::HA-PAP2 cop1-4 overexpressing plants is further stabilized in darkness and light compared to overexpressing lines in wild-type background, supporting the hypothesis that COP1/SPA complexes regulate PAP protein levels under both conditions.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Pflanzen sind als sessile Organismen auf eine komplexe Interaktion mit ihrer Umgebung angewiesen. In dieser Hinsicht ist Licht einer der wichtigsten Faktoren, der in viele Stadien des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung eingreift. Die E3-Ubiquitin Ligase COP1 und SPA-Proteine (SPA1-SPA4) repremieren zusammen die Lichtsignaltransduktion im Dunkeln. Zusätzlich wurden COP1 und SPA-Proteine auch im Zusammenhang mit z.B. der Regulation der Blattgröße, der Differenzierung der Spaltöffnungen und der Bestimmung des Blühzeitpunktes identifiziert. Es wurde gezeigt, dass COP1 Transkriptionsfaktoren wie HY5, HFR1 und CO ubiquitiniert und durch den 26S Protasom Proteinkomplex degradiert werden. In der hier vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass SPA Proteine in vitro und in planta miteinander in Homo- und Heterodimeren interagieren. Diese Tatsache legt die Existenz von größeren Proteinkomplexen unter der Beteiligung von COP1 und SPA-Proteinen, in denen jede Kombination von SPA-Dimeren vertreten ist, nahe. Ferner konnte gezeigt werden, dass SPA-Proteine über ihren N-Terminus, der zusätzlich die Coiled-Coil-Domäne beinhaltet, miteinander interagieren. Da SPA-Proteine überlappende, aber auch unterschiedliche Funktionen in der Pflanzenentwicklung ausüben, und dies nicht allein durch mRNA- und Protein-Expressionsmuster erklärt werden kann, muss es andere Mechanismen geben, die die Assemblierung und/oder Aktivität von COP1/SPA-Komplexen regulieren. Durch die Analyse von SPA1- und SPA2-Proteinmengen in dunkelrotem Licht verglichen mit denen aus Dunkelheit unter Zuhilfenahme von in dieser Arbeit hergestellten Antikörpern, konnte gezeigt werden, dass SPA-Proteinmengen im Licht verglichen mit denen in Dunkelheit abnehmen. Unter Beachtung der Transkriptpegel, weist dies auf einen posttranslationalen Mechanismus hin, der die Funktion der SPA-Proteine reguliert. Ob COP1 direkt Einfluss auf die lichtabhängige Akkumulation von SPAProteinen Einfluss nimmt, muss noch geklärt werden. COP1/SPA-Komplexe üben aller Voraussicht nach ihre Regulation in einem breiten Spektrum von Entwicklungsprozessen aus. Aus diesem Grund wurden zwei neue potentielle Zielproteine für den COP1/SPA-Komplex untersucht. PAP1 und PAP2 sind Transkriptionsfaktoren, die in der lichtabhängigen Regulation der Anthozyanbiosynthese involviert sind. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass beide Proteine mit den Komponenten des COP1/SPA-Komplexes in Hefe interagieren können. Ferner wurden PAP1 und PAP2 in 35S-Überexressoren durch Licht stabilisiert und konnten durch Zugabe des Proteasominhibitors MG132 angereichert werden, was eine posttranslationale Regulation der PAP-Protein nahelegt. Die Analyse von RNAi-Mutanten und PAP-Überexpressoren im cop1-4-mutanten Hintergrund zeigte einen Effekt der cop1-Mutation auf PAP-abhängige Anthozyanbiosynthese. Darüber hinaus zeigte ein erstes Experiment in 35S::HAPAP2 cop1-4-überexpremierenden Pflanzen, dass das PAP2-Protein im Licht und in Dunkelheit im Vergleich zu Überexpressoren im Wildtyphintergrund stärker stabilisiert wurde. Dies bekräftigt die Hypothese, dass COP1/SPA-Komplexe PAP-Proteinmengen unter beiden Bedingungen regulieren. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Maier, Alexander maierale@googlemail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-45072
Date:	2011
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Light English Photomorphogenesis English Arabidopsis English
Date of oral exam:	25 May 2011
Referee:	Name Academic Title Höcker, Ute Prof. Dr. Hülskamp, Martin Prof. Dr. Werr, Wolfgang Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4507