Universität zu Köln

Naumann, Anja Barbara (2011). Epigenetische und funktionelle Charakterisierung der 5'-upstream Region des menschlichen FMR1 Gens. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Das mit der Folat-sensitiven fragilen Stelle FRAXA assoziierte fragile X mentale Retardierung Gen 1 (FMR1) liegt auf dem menschlichen X-Chromosom (Xq27.3). Die instabile Amplifikation einer 5'-(CGG)n-3' Repetition in der 5'-nicht-translatierten Region des ersten Exons des FMR1 Gens kann zu drei phänotypisch verschiedenen Krankheiten führen, zur fragilen X assoziierten vorzeitigen Ovarialinsuffizienz, zum fragilen X assoziierten Tremor/Ataxie Syndrom und zum fragilen X Syndrom (FXS). Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte erstmals eine deutliche Methylierungsgrenze in einem Bereich von 650 bis 800 Nukleotiden stromaufwärts der 5'-(CGG)n-3' Repetition des FMR1 Gens aufgezeigt werden. Diese durch Bisulfit-Sequenzierung identifizierte Methylierungsgrenze ist konserviert und kommt unabhängig vom Alter, Geschlecht und Entwicklungsstadium in allen menschlichen Zelltypen und Zelllinien vor. Die Übergangsregion der Methylierungsgrenze im 5'-gelegenen Bereich stromaufwärts des menschlichen FMR1 Gens bindet spezifisch Kernproteine. Auch in verschiedenen Geweben der Maus konnte eine deutliche Methylierungsgrenze nachgewiesen werden, obwohl die Nukleotid-Sequenz vor der 5'-(CGG)n-3' Repetition des homologen Fmr1 Gens des X-Chromosoms der Maus (A7.1) mit dem menschlichen FMR1 Gen nur zu 46,7% identisch ist. Der Bereich stromaufwärts des menschlichen Huntingtin Gens (HTT) auf dem kurzen Arm des Chromosoms 4 (4p16.3), mit einer 5'-(CAG)n-3' Repetition im kodierenden Bereich des ersten Exons, weist ebenfalls eine deutliche Methylierungsgrenze auf. Die Transformation von menschlichen Zellen ohne FXS durch Epstein-Barr-Virus oder Telomerase führt nicht zur Destabilisierung der Methylierungsgrenze und zur Ausbreitung der DNA-Methylierung in Richtung des FMR1 Promotors. Die eingebrachte fremde DNA führte jedoch in einem unbekannten Mechanismus zu einem Verlust der DNA-Methylierung in dem ursprünglich stark methylierten Bereich, der weiter stromaufwärts zur Methylierungsgrenze liegt. Eine ähnliche Abnahme der Methylierung wurde auch in Zellkultur wachsenden, nicht-transformierten FXS Fibroblastenzellen beobachtet. Die DNA von FXS Individuen zeichnet sich durch den Verlust der Methylierungsgrenze und Ausbreitung der DNA-Methylierung stromabwärts bis in den FMR1 Promotor aus. Die Analyse der FXS Genome ergab keine Mutationen oder Veränderungen, verglichen mit der normalen DNA-Sequenz des Menschen. Der FXS-assoziierte Verlust der Methylierungsgrenze kann folglich nicht einfach durch eine mutierte Nukleotid-Sequenz erklärt werden. In dem fast vollständig de novo methylierten FMR1 Promotorbereich in FXS Individuen wurden isoliert nicht-methylierte CpG-Folgen gefunden. Diese isoliert nicht-methylierten CpG-Folgen sind nur bei einer de novo Methylierung in lebenden Säugerzellen und Organismen nachweisbar, aber nicht während der in vitro Methylierung der gleichen FMR1 Sequenz durch die bakterielle SssI-Methylase. In weiblichen Vollmutations-Trägerinnen war die ursprüngliche Methylierungsgrenze nur noch in wenigen DNA-Molekülen intakt. Bei männlichen wie weiblichen Prämutations-Überträgern konnte eine stabile Methylierungsgrenze nachgewiesen werden, ebenso in den männlichen Vollmutations-Trägern ohne FXS aber mit expandierter 5'-(CGG)n-3' Repetition, den sogenannten high-functioning males (HFM). Eine stabile Methylierungsgrenze in den HFM scheint von wesentlicher Bedeutung für die Funktionsfähigkeit des FMR1 Promotors zu sein. Die Wichtigkeit der Methylierungsgrenze wird zudem unterstützt durch den Verlust der Methylierungsgrenze im regulatorischen Bereich des Entwicklungs-relevanten menschlichen FMR1 Gens im fragilen X Syndrom. Eine spezifische Chromatinstruktur im Bereich der Methylierungsgrenze könnte für die Stabilität verantwortlich sein und eine Ausbreitung der DNA-Methylierung über die Promotorregion des FMR1, Fmr1 und HTT Gens verhindern. Die Aufrechterhaltung der Methylierungsgrenze des FMR1 Gens könnte somit ein wichtiger Faktor für den Schutz gegen das fragile X Syndrom sein.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language The folate-sensitve fragile site FRAXA associated with the fragile X mental retardation gene 1 (FMR1) is located on human X chromosome (Xq27.3). The unstable expansion of a 5'-(CGG)n-3' repeat in the 5'-untranslated region of the first exon of the FMR1 gene can lead to three phenotypically different diseases, the fragile X associated premature ovarian insufficiency, the fragile X associated tremor/ataxia syndrome and the fragile X syndrome (FXS). This thesis work revealed for the first time a distinct methylation boundary at a genome location 650 to 800 nucleotides upstream of the 5'-(CGG)n-3' repeat in the FMR1 gene. This boundary, identified by bisulfite sequencing, is conserved and present in all human cell types and cell lines, irrespective of age, gender, and developmental stage. The transition sequence of the methylation boundary in the 5'-upstream region of the human FMR1 gene binds specifically nuclear proteins. The same distinct methylation boundary is also found in different mouse tissues, although the nucleotide sequence upstream of the 5'-(CGG)n-3' repeat between the mouse Fmr1 gene on chromosome X (A7.1) and the human FMR1 gene shows only 46.7% homology. The upstream region of the human huntingtin gene (HTT) located on the short arm of chromosome 4 (4p16.3) with a 5'-(CGG)n-3' repeat in the coding region of the first exon, also carries a distinct methylation boundary. Transformation of human cells without FXS by Epstein-Barr-Virus or the telomerase gene does not compromise the stability of the methylation boundary. Hence methylation does not spread into the FMR1 promoter. By an unknown mechanism, the introduction of foreign DNA leads to the loss of methylation in the usually hypermethylated region far upstream of the methylation boundary. A similar decrease of the methylation was also observed in non-transformed FXS fibroblasts, growing in culture. In genomes of FXS individuals the methylation boundary is lost, the methylation spreads downstream and extends across the FMR1 promoter. The analysis of FXS genomes did not reveal mutations or deviations when compared to the standard human DNA sequence. Thus, the FXS-associated loss of the methylation boundary cannot be simply explained by a mutated nucleotide sequence. In the almost completely de novo methylated FMR1 promoter region in FXS individuals, isolated unmethylated CpG dinucleotides have been observed. These isolated unmethylated CpG dinucleotides arise only during de novo methylation in living cells and organisms but not during in vitro methylation of the same FMR1 sequence by the bacterial SssI methylase. In female full mutation individuals the methylation boundary was still intact in only a few genomes. In male and female premutation carriers a stable methylation boundary was also preserved, as well as in high-functioning males (HFM) with an expansion of the 5'-(CGG)n-3' repeat to full mutation lengths but without the FXS phenotype. A stable methylation boundary in HFM seems to be necessary for the functionality of the FMR1 promoter. The significance of the methylation boundary is also supported by its deletion in the regulatory region of the developmentally important human FMR1 gene in the fragile X syndrome. The stability of the methylation boundary could be preserved by a specific chromatin structure in the boundary region that prevents methylation spreading into the promoter region of the FMR1, Fmr1 and HTT gene. The mainenance of the methylation boundary in the FMR1 5'-upstream region is most likely an important factor in the protection against the fragile X syndrome. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Naumann, Anja Barbara anja.naumann@viro.med.uni-erlangen.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-45228
Date:	December 2011
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language FMR1, fragiles X Syndrom, DNA-Methylierung, Methylierungsgrenze, Epigenetik German FMR1, fragile X syndrome, DNA methylation, methylation boundary, epigenetics English
Date of oral exam:	24 January 2012
Referee:	Name Academic Title Doerfler, Walter Prof. Dr. Brüning, Jens Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4522