Thelen, Maximilian Paul 
ORCID: 0000-0003-1714-1179
(2021).
Defective Mitochondria Contribute to Impaired Translation in Spinal Muscular Atrophy.
PhD thesis, Universität zu Köln.
Abstract
Spinal muscular atrophy (SMA) is a devastating, autosomal-recessive neurodegenerative disease. It is characterized by the loss of alpha motor neurons (MNs) located in the ventral horn of the spinal cord. Degeneration of lower MNs leads to proximal muscle weakness and can ultimately result in respiratory failure. Accordingly, SMA is among the most common genetic causes of infant death. Causative for SMA is a reduced survival motor neuron (SMN) protein level. The reduction of ubiquitously expressed SMN results mainly from biallelic deletions or partially from point mutations in the SMN1 gene. Solely an almost identical copy of SMN1 - SMN2 - prevents embryonic lethality in SMA patients. A plethora of molecular defects, including RNA processing, protein synthesis, metabolic defects, and mitochondrial function, contribute to SMA pathology. Furthermore, reduced SMN levels delay maturation of acetylcholine receptor subunits and morphological and functional abnormalities at the neuromuscular junction.
Neurons highly depend on energy production via oxidative phosphorylation (OXPHOS) by mitochondria. Dysfunctional mitochondria in SMA produce fewer ATP molecules and generate massive amounts of reactive oxygen species (ROS), resulting in oxidative stress. Oxidative stress challenges the cells with DNA damage, protein carbonylation, and impaired protein synthesis. Based on these findings, we hypothesized that defective mitochondria contribute to impaired protein synthesis in SMA. Another central question is whether in- creasing ATP and reducing oxidative stress ameliorates SMA pathology.
We performed a whole proteome analysis of cultured primary MNs, derived from SMA and WT embryos. Using mass spectrometry (MS), we confirmed previously known molecular mechanisms altered by SMN deficiency and contributing to SMA pathology. Particularly, a tendency of altered proteins localized to mitochondria was determined. In detail, complex I of the respiratory chain was identified as the major disturbed complex in SMA mitochondria. Besides alterations in mitochondrial protein abundance, immunostainings showed a decreased number and altered mitochondrial shape in the axon of SMA MNs. However, results from the whole proteome analysis and immunochemical results reveal an increase of mitochondrial proteins in whole-cell lysates, suggesting an accumulation of dysfunctional mitochondria in the soma.
Biochemical assays revealed functional impairments such as reduced ATP, impaired respiratory complex I activity, and increased ROS production. Additionally, a reduced glucose uptake suggested no compensation of energy deprivation by glycolysis. Previous studies implicated a reduced protein synthesis in SMA. We confirmed those findings with this study and further linked reduced protein synthesis to protein carbonylation resulting from increased oxidative stress. Moreover, we provide evidence that protein synthesis is also reduced in the axonal compartment of SMA MNs. Protein carbonylation and protein synthesis were quantified using immunochemical approaches. These findings prompted us to evaluate the mechanism of impaired protein synthesis. To decipher the contribution of translation initiation and elongation during impaired protein synthesis, we performed the SUnSET and SunRiSE assay, respectively. Based on our results, impaired protein synthesis in SMA results from impaired translation initiation and not elongation. While the SunRiSE assay shows a similar elongation speed in WT and SMA MNs, the phosphorylation status of the eIF4E-binding protein (4E-BP) reveals an impaired translation initiation in SMA MNs.
To increase ATP and decrease ROS, the cell culture medium of MNs and MN-like NSC-34 cells was supplied with lactate, pyruvate, and N-acetylcysteine (NAC). Effects of substrate supplementation on the whole proteome of MNs were determined by MS. Supplementation of pyruvate was able to increase ATP levels in SMA MNs, measured biochemically. Furthermore, pyruvate and NAC supplementation reduced excessive ROS and improved impaired protein synthesis, including local translation in SMA MNs.
While the antioxidant NAC can enhance global mRNA translation, pyruvate could only increase a subset of proteins. However, both pyruvate and NAC increased SMN in SMA MNs. Downstream targets of the mTOR pathway were measured immunochemically after NAC and pyruvate supplementation. Up-regulation of protein synthesis upon NAC and pyruvate supplementation is due to increased translation initiation mediated by the mTOR pathway. The mTOR-mediated increase of SMN after pyruvate supplementation was confirmed by pharmacological inhibition of the mTOR pathway.
In summary, we found that excessive ROS generated by defective complex I inhibits the initiation of mRNA translation in SMA MNs. Our findings suggest a new molecular networking system among dysfunctional mitochondria, excessive ROS production, and impaired protein synthesis via the mTOR pathway. This study opens up new treatment possibilities concerning SMA pathology by improving mitochondria, reducing ROS, and influencing impaired protein synthesis. As many neuropathies display molecular defects in mitochondria, including excessive ROS production, additional research fields despite SMA will benefit from our study.
| Item Type: |
Thesis
(PhD thesis)
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| Translated abstract: |
| Abstract | Language |
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| Die Spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine verheerende, autosomal-rezessive neurodegener- ative Erkrankung. Sie ist gekennzeichnet durch den Verlust von Alpha-Motorneuronen (MN), die sich im ventralen Horn des Rückenmarks befinden. Die Degeneration der unteren MN führt zu einer proximalen Muskelschwäche und kann schließlich zu einem Atemstillstand führen. Dementsprechend gehört die SMA zu den häufigsten genetischen Ursachen des Kindstodes. Ursächlich für die SMA ist ein verminderter Survival Motor Neuron (SMN) Proteinspiegel. Die Reduktion des ubiquitär vorkommenden SMN resultiert hauptsächlich aus biallelischen Deletionen oder teilweise aus Punktmutationen im SMN1- Gen. Lediglich eine fast identische Kopie von SMN1 - SMN2 - verhindert die embryonale Letalität bei SMA-Patienten. Eine Fülle von molekularen Defekten, einschließlich RNA- Verarbeitung, Proteinsynthese, Stoffwechseldefekten und mitochondrialen Funktionen, tragen zur SMA-Pathologie bei. Darüber hinaus verzögern reduzierte SMN-Spiegel die Reifung von Acetylcholinrezeptor-Untereinheiten und führen zu morphologischen und funktionellen Anomalien an der neuromuskulären Endplatte.
Neuronen sind in hohem Maße von der Energieproduktion über oxidative Phospho- rylierung (OXPHOS) durch Mitochondrien abhängig. Dysfunktionale Mitochondrien in SMA produzieren weniger ATP-Moleküle und erzeugen massive Mengen an reaktiven Sauerstoff- spezies (ROS), was zu oxidativem Stress führt. Oxidativer Stress belastet die Zellen mit DNA-Schäden, Protein-Carbonylierung und beeinträchtigter Proteinsynthese. Basierend auf diesen Erkenntnissen stellten wir die Hypothese auf, dass defekte Mitochondrien zu einer gestörten Proteinsynthese bei SMA beitragen. Eine weitere zentrale Frage ist, ob die Erhöhung von ATP und die Reduzierung von oxidativem Stress die SMA-Pathologie verbessert.
Wir führten eine Analyse des gesamten Proteoms von kultivierten primären MN, die von SMA- und WT-Embryonen stamen, durch. Mittels Massenspektrometrie (MS) konnten wir bereits bekannte molekulare Mechanismen bestätigen, die durch SMN-Mangel verändert werden und zur SMA-Pathologie beitragen. Insbesondere zeichnete sich eine Tendenz ab von veränderten Proteinen, die in Mitochondrien lokalisiert sind. Der Komplex I der Atmungskette wurde als der am meisten gestörte Komplex in SMA-Mitochondrien identifiziert. Neben Veränderungen in der mitochondrialen Proteinhäufigkeit zeigten Immunfärbungen eine verminderte Anzahl und veränderte Form der Mitochondrien im Axon von SMA-MN. Die Ergebnisse der Gesamtproteomanalyse sowie immunochemische Versuche zeigen jedoch einen Anstieg der mitochondrialen Proteine in Lysaten ganzer Zellen, was auf eine Anhäufung von dysfunktionalen Mitochondrien im Soma hindeutet.
Biochemische Versuche zeigten funktionelle Beeinträchtigungen wie reduziertes ATP, beeinträchtigte Aktivität des Atmungskomplexes I und erhöhte ROS-Produktion. Zusätzlich deutete eine reduzierte Glukoseaufnahme auf eine fehlende Kompensation des Energieman- gels durch die Glykolyse hin. Frühere Studien deuteten auf eine reduzierte Proteinsynthese bei SMA hin. Wir bestätigten diese Ergebnisse mit dieser Studie und brachten die reduzierte Proteinsynthese mit der Proteincarbonylierung in Verbindung, die durch erhöhten oxidativen Stress entsteht. Außerdem konnten wir nachweisen, dass die Proteinsynthese auch im axonalen Kompartiment von SMA-MN reduziert ist. Die Protein-Carbonylierung und die Proteinsynthese wurden mit immunochemischen Ansätzen quantifiziert. Diese Ergebnisse veranlassten uns, den Mechanismus der gestörten Proteinsynthese zu untersuchen. Um den Beitrag der Translationsinitiation und -elongation während der gestörten Proteinsynthese zu entschlüsseln, führten wir den SUnSET- bzw. SunRiSE-Assay durch. Basierend auf unseren Ergebnissen resultiert die gestörte Proteinsynthese bei SMA aus einer gestörten Translationsinitiation und nicht aus der Elongation. Während der SunRiSE-Assay eine ähnliche Elongationsgeschwindigkeit in WT- und SMA-MN zeigt, offenbart der Phospho- rylierungsstatus des eIF4E-bindenden Proteins (4E-BP) eine gestörte Translationsinitiation in SMA-MN.
Um ATP zu erhöhen und ROS zu verringern, wurde das Zellkulturmedium von MN und MN-ähnlichen NSC-34-Zellen mit Laktat, Pyruvat und N-Acetylcystein (NAC) zugesetzt. Die Auswirkungen der Substratsupplementierung auf das gesamte Proteom der MN wurden mittels MS bestimmt. Die Supplementierung von Pyruvat war in der Lage, den ATP-Gehalt in SMA-MN zu erhöhen, was biochemisch gemessen wurde. Außerdem reduzierte die Pyruvat- und NAC-Supplementierung exzessive ROS und verbesserte die beeinträchtigte Proteinsynthese, einschließlich der lokalen Translation in SMA-MN.
Während das Antioxidant NAC die globale mRNA-Translation verbessern kann, konnte Pyruvat nur eine Untergruppe von Proteinen erhöhen. Allerdings erhöhten sowohl Pyruvat als auch NAC SMN in SMA-MN. Nachgeschaltete Ziele des mTOR-Wegs wurden nach NAC- und Pyruvat-Supplementierung immunochemisch gemessen. Die Hochregulierung der Proteinsynthese nach NAC- und Pyruvat-Supplementierung ist auf eine erhöhte Trans- lationsinitiation zurückzuführen, die durch den mTOR-Signalweg vermittelt wird. Der mTOR-vermittelte Anstieg von SMN nach Pyruvat-Supplementierung wurde durch phar- makologische Hemmung des mTOR-Weges bestätigt.
Zusammenfassend fanden wir, dass exzessive ROS, die durch einen defekten Komplex I erzeugt werden, die Initiation der mRNA-Translation in SMA MN hemmen. Unsere Ergebnisse deuten auf eine neue molekulare Verbindung zwischen dysfunktionalen Mitochondrien, exzessiver ROS-Produktion und gestörter Proteinsynthese über den mTOR-Weg hin. Diese Studie eröffnet neue Behandlungsmöglichkeiten bezüglich der SMA-Pathologie, indem sie die Mitochondrien verbessert, ROS reduziert und die gestörte Proteinsynthese beeinflusst. Da viele Neuropathien molekulare Defekte in Mitochondrien aufweisen, einschließlich einer übermäßigen ROS-Produktion, werden weitere Forschungsfelder zusätzlich zur SMA von unserer Studie profitieren. | German |
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| Creators: |
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| URN: |
urn:nbn:de:hbz:38-468743 |
| Date: |
10 February 2021 |
| Language: |
English |
| Faculty: |
Faculty of Mathematics and Natural Sciences |
| Divisions: |
Zentrum für Molekulare Medizin |
| Subjects: |
Life sciences |
| Uncontrolled Keywords: |
| Keywords | Language |
|---|
| Spinal muscular atrophy | English | | SMN | English | | SMN1 | English | | SMN2 | English | | Mitochondria | English | | Reactive oxygen species | English | | Translation initiation | English |
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| Date of oral exam: |
26 April 2021 |
| Referee: |
| Name | Academic Title |
|---|
| Wirth, Brunhilde | Prof. Dr. | | Rugarli, Elena I. | Prof. Dr. |
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| Refereed: |
Yes |
| URI: |
http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/46874 |
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