Universität zu Köln

Rybniker, Jan (2012). Identification and Characterization of Host Shut-Off Proteins of Mycobacteriophages. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Mycobacteriophages are viruses that infect exclusively mycobacteria. In this work I screened mycobacteriophage genomes for host shut-off proteins, proteins that are capable of down-regulating the mycobacterial metabolism early in the infectious cycle. These proteins are of interest in the drug-target discovery process of important pathogens such as Mycobacterium tuberculosis. Several host shut-off proteins were identified and characterized with regard to functional and regulatory aspects. Geneproduct 49, the WhiB-like protein of mycobacteriophage TM4 (WhiBTM4) was shown to be growth inhibitory in the mycobacterial host upon induction of expression. Like its homologue in the host (WhiB2), this viral protein is capable of co-ordinating an iron-sulfur (Fe-S) cluster. The UV-visible absorption spectra obtained from freshly purified and reconstituted WhiBTM4 were consistent with the presence of an oxygen sensitive [2Fe-2S] cluster. The quantification of mRNA-levels during phage infection showed that whiBTM4 is a highly transcribed early phage gene and a dominant negative regulator of WhiB2, an essential mycobacterial protein. Strikingly, both apo-WhiB2 of M. tuberculosis and apo-WhiBTM4 were capable of binding to the conserved promoter region upstream of the whiB2 gene indicating that WhiB2 regulates its own synthesis which is inhibited in the presence of WhiBTM4. Thus, within this work, substantial evidence could be provided, supporting the hypothesis of viral and bacterial WhiB proteins being important Fe-S containing transcriptional regulators with DNA-binding capability. In mycobacteriophage L5 three open reading frames within an early operon were identified as toxic to the host M. smegmatis when expressed from an inducible expression vector. These ORFs coding for gp77, gp78 and gp79 presumably function as shut-off genes during early stages of phage replication. There is evidence, that the cell division is affected by one of the proteins (gp79). The transcription of the cytotoxic polypeptides is directed by a promoter situated in ORF83 and transcription control is achieved through the phage repressor gp71 which was shown by co-expression of this protein. The findings presented here can provide useful tools for the molecular genetics of mycobacteria. The mycobacteriophage L5 early protein gp77 was further characterized with regard to its possible function within the host. I provide data showing that this purified phage protein of unknown function specifically binds to protein MSMEG_3532 when incubated with protein lysates of Mycobacterium smegmatis. This interaction was confirmed by pull-down assays using purified MSMEG_3532 as bait which co-purified with gp77. The amino acid sequence of MSMEG_3532 is nearly identical to that of threonine dehydratases, serine dehydratases and an L-threo-3-hydroxyaspartate dehydratase. An enzymatic assay confirmed this host protein as a pyridoxal-5'-phosphate-dependent L-serine dehydratase (SdhA) which converts L-serine to pyruvate. This is the first biochemical characterization of a serine dehydratase derived from mycobacteria. Though the addition of purified gp77 to the established in vitro assay had no influence on the enzymatic activity of MSMEG_3532, the specific interaction of phage protein and dehydratase in vivo may well have a role in altering the amino acid pool or the products of amino acid metabolism in favour of phage maturation.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Mykobakteriophagen sind Viren die ausschließlich Mykobakterien infizieren. In dieser Arbeit wurden Genome von Mykobakteriophagen dahin gehend untersucht, ob sie für host shut-off proteine kodieren. Diese Proteine führen direkt nach der Injektion viraler DNS in den Wirt zur Herabregulation des Wirtsstoffwechsels und können für die Identifikation von drug targets wichtiger humanpathogener Erreger wie zum Beispiel Mycobacterium tuberculosis von Interesse sein. Mehrere host shut-off Proteine konnten in dieser Arbeit identifiziert und charakterisiert werden. Das WhiB-ähnliche Genprodukt 49 des Mykobakteriophagen TM4 (WhiBTM4) hatte nach konditioneller Expression wachstumsinhibierende Eigenschaften. Sowohl das aufgereinigte Protein WhiBTM4 wie auch ein homolges und essentielles Protein des Wirts (WhiB2) waren in der Lage einen Eisen-Schwefel-Cluster (Fe-S) zu bilden. Das UV-vis Absorptionsspektrum von frisch aufgereinigtem und anaerob rekonstituiertem WhiBTM4-Protein zeigte einen sauerstofflabilen [2Fe-2S] cluster. Die Quantifizierung der mRNA während der Phageninfektion ergab, dass whiBTM4 früh im Infektionszyklus transkribiert wird und ein dominant negativer Regulator von WhiB2 ist. Interessanter weise waren sowohl apo-WhiB2 von M. tuberculosis wie auch apo-WhiBTM4 in der Lage die hoch konservierte whib2 Promoter-Region zu binden. Man kann also schlussfolgern, dass das WhiB2-Protein ein selbst-regulierendes Protein ist, das in der Gegenwart von WhiBTM4 herabreguliert wird. Somit konnten in dieser Arbeit wichtige Hinweise identifiziert werden, die zeigen, dass es sich bei viralen und bakteriellen WhiB-Proteinen um Fe-S haltige Transkriptionsfaktoren mit DNS-Bindungseigenschaften handelt. Drei open reading frames eines Operons des Mykobakteriophagen L5 wirkten nach konditioneller Expression ebenfalls wachstumsinhibierend auf den Wirt Mycobacterium smegmatis. Diese ORFs (gp77, gp78 und gp79) fungieren wahrscheinlich als host shut-off proteine und es gibt Hinweise darauf, dass gp79 die Zellteilung des Wirts unterbricht. Die Transkription der zytotoxischen Polypeptide wird durch einen neu identifizierten Promoter im Gen 83 angeschaltet. Reguliert wird dieser Promoter durch das Repressor-Protein gp71, was durch Co-Expressions-Versuche gezeigt werden konnte. Diese Daten können für die Entwicklung neuer Werkzeuge der mykobakteriellen Molekulargenetik von Nutzen sein. Das Mykobakteriphagen-Protein gp77 wurde bezüglich seiner möglichen intrazellulären Funktion im Wirt untersucht. So konnte gezeigt werden, dass das aufgereinigte Protein das Wirtsprotein MSMEG_3532 in vitro bindet. Diese Interaktion konnte über umfangreiche pull-down-Experimente verifiziert werden. Die Aminosäuresequenz des Proteins ist nahezu identisch mit der Sequenz bereits charakterisierter Enzyme wie der Threonin Dehydratase, Serin Dehydratase and der L-Threo-3-Hydroxyaspartat Dehydratase. In einem enzymtischen Assay konnte gezeigt werden, dass es sich um eine Pyridoxal-5'-Phosphat-abhängige L-Serin Dehydratase (SdhA) handelt, die L-Serin zu Pyruvat umwandelt. Es handelt sich somit um die erste biochemische Charakterisierung eines solchen Enzyms bei Mykobakterien. Auch wenn im beschriebenen Ansatz die Interaktion von gp77 mit SdhA in vitro nicht zur Inhibition der enzymatischen Aktivität führte, könnte die Interaktion in vivo durchaus eine Rolle spielen, zum Beispiel in der Alteration des Aminosäurepools oder des Aminosäurestoffwechsels während der Bakteriophageninfektion. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Rybniker, Jan jan.rybniker@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Contributors:	ZMMK
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-46960
Date:	2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Ehemalige Fakultäten, Institute, Seminare > Faculty of Mathematics and Natural Sciences > no entry
Subjects:	Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Bacteriophage English Mycobacteriophage English Mycobacterium English
Date of oral exam:	17 October 2011
Referee:	Name Academic Title Schnetz, Karin Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4696