Universität zu Köln

Bieling, Angela Maria (2012). Zelluläre Antwort auf mitochondrialen Stress infolge einer Nonsense-Mutation in der Cytochrom-c-Oxidase Untereinheit 1 (COX1) in humanen Cybridzellen. Thesis Abstract, Universität zu Köln.

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Abstract

Punktmutationen in der mitochondrialen DNA (mtDNA) führen zur Bildung defekter Proteine und folglich zu Atmungskettendefekten, welche verschiedenste Erkrankungen im Menschen verursachen. Bisher wurde angenommen, dass mutierte Proteine nicht in die Atmungskettenkomplexe eingebaut werden können und durch mitochondriale Qualitäts- kontrollproteasen abgebaut werden. Um die Mechanismen des selektiven Proteinabbaus und der mitochondrialen Stressantwort detaillierter zu verstehen, wurde eine Cybridzell- linie mit einer G6930A Punktmutation in der Cytochrom-c-Oxidase Untereinheit 1 des Komplex IV untersucht. Durch die Mutation entsteht ein Stopp-Codon und folglich ein um 30 % verkürztes Protein, welches jedoch in nicht nachweisbarer Menge vorliegt. In G6930A Cybridzellen liegen neben dem Komplex IV-Defekt auch verminderte Aktivitä- ten und Mengen der Atmungskettenkomplexe I, II und III vor. Um die nukleäre Antwort auf den mitochondrialen Stress zu analysieren, wurde eine Genexpressionsanalyse (mRNA-Array) durchgeführt und eine reduzierte Genexpression vieler nukleär kodierter Atmungskettenuntereinheiten festgestellt. Eine kompensatori- sche Hochregulation der mitochondrialen Biogenese konnte somit ausgeschlossen wer- den. Zusätzlich waren die mRNA- und Proteinmengen der mitochondrialen Qualitäts- kontrollproteasen AFG3L2 und YME1L1 hochreguliert. Um die Rolle und den Effekt der Protease AFG3L2 im Abbau von Atmungskettenuntereinheiten zu untersuchen, wur- den Pulse Chase Experimente nach transienter Transfektion von AFG3L2-Varianten und transientem AFG3L2-Knockdown durchgeführt. Während die Überexpression der Wild- typform von AFG3L2 in einem erhöhten Abbau von Atmungskettenuntereinheiten re- sultierte, führte sowohl die Überexpression der dominant negativen AFG3L2-Variante (AFG3L2E408Q ) als auch der Knockdown zu einer gesteigerten Stabilität. Die äußerst wichtige Rolle von AFG3L2 im Abbau von Atmungskettenuntereinheiten konnte auf die- se Weise demonstriert werden. Darüber hinaus wurde das verkürzte COX1 Protein, sowie andere Atmungskettenuntereinheiten der Komplexe I, IV und V mit Hilfe von Pulldown- Experimenten als Substrate von AFG3L2 identifiziert. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse lassen auf einen gegenseitigen Austausch von Informationen zwischen Mitochondrien und Nukleus schließen, um die Anreicherung von fehlgefalteten und nicht-assemblierten Atmungskettenuntereinheiten und einen da- mit verbundenen negativen Effekt in den Mitochondrien zu verhindern. Dieses Ziel wird zum einen durch die herunterregulierte Genexpression von kernkodierten mitochondrialen Atmungskettenuntereinheiten und zum anderen durch die Hochregulation der mitochon- drialen Qualitätskontrollproteasen erreicht.

Item Type:	Thesis Abstract
Translated abstract:	Abstract Language Point mutations in the mitochondrial DNA (mtDNA) result in the formation of defective proteins and thus in respiratory chain deficiencies, which cause heterogeneous disorders in humans. It was believed that mutated proteins are not assembled into respiratory chain complexes and are degraded by inner membrane quality control proteases. To understand the mechanisms of selective protein degradation and of mitochondrial stress response in more detail, a cybrid cell line containing a G6930A point mutation in the cytochrome c oxidase subunit 1 (COX1) of complex IV was studied. The mutation causes the formation of a premature stop-codon and thus a 30 % truncated protein is built, which however does not accumulate to steady state levels. G6930A cybrid cells not only show a complex IV defect, but the activities and steady state levels of respiratory chain complexes I, II and III are also impaired. To investigate the nuclear response to mitochondrial stress, gene expression analysis (mRNA-Array) was performed, which revealed a decreased expression of many nuclear genes encoding respiratory chain subunits, excluding a compensatory upregulation of mitochondrial biogenesis. In addition mRNAs and proteins of the mitochondrial quality control proteases AFG3L2 and YME1L1 were upregulated. To investigate the role and the effect of the protease AFG3L2 in the degradation of respiratory chain (RC) subunits, pulse chase experiments were performed after transient transfection of AFG3L2 vari- ants and after transient knockdown of AFG3L2. Overexpression of wild type AFG3L2 resulted in a higher degradation rate of RC subunits, whereas the overexpression of a dominant negative AFG3L2 variant (AFG3L2E408Q ) and the knockdown led to increased stability of RC subunits, demonstrating the crucial role of AFG3L2 in the degradation of mitochondrially encoded subunits. Furthermore the truncated COX1 protein as well as other respiratory chain subunits of complex I, IV and V were identified as substrates of AFG3L2 by pull-down experiments. The data suggest a crosstalk between mitochondria and the nucleus to prevent accu- mulation of misfolded and unassembled respiratory chain proteins, thus preventing their possibly harmful effect in mitochondria. This objective is achieved on the one hand by downregulating gene expression of nuclear encoded respiratory chain subunits and on the other hand by upregulating mitochondrial quality control proteases. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bieling, Angela Maria angela.bieling@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Creators:	Universitätsklinikum Köln
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-48133
Series Name:	Ergebnisse aus den Naturwissenschaften
Volume:	1
Date:	2012
Publisher:	Apprimus Verlag
ISBN:	978-3-86359-075-8
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Mitochondrien German Proteasen German COX 1 German
Date of oral exam:	12 April 2012
Referee:	Name Academic Title Langer, Thomas Univ.-Prof. Dr. rer nat Wiesner, Rudolf J. Univ.-Prof. Dr. rer nat
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4813