Universität zu Köln

Hussain, Muhammad Sajid (2011). Molecular Genetic Analysis of Autosomal Recessive Primary Microcephaly in Pakistani Kindreds. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Autosomal recessive primary microcephaly (MCPH) is a rare genetic disorder in which the afflicted individuals have head circumference more than 3 SDs below the age- and sex-related mean. The reduced head circumference is due to a small but architecturally normal cerebral cortex. MCPH is characterized by a pronounced heterogeneity with seven loci, designated MCPH1-7, have already been identified. The underlying genetic defects were found in the following seven genes, MCPH1, WDR62, CDK5RAP2, CEP152, ASPM, CENPJ, and STIL/SIL. The incidence of this disorder is highest in Pakistan (Woods et al., 2005). Here, I ascertained thirty families with MCPH from various regions of Pakistan. Homozygosity mapping revealed linkage in 19 families to the MCPH5 locus, in 2 to MCPH2, in 2 to MCPH4, in 1 to MCPH1, in 1 to MCPH6, and in 5 families linkage to all known MCPH loci was excluded. Families linked to the MCPH1, MCPH2, MCPH5, and MCPH6 loci were also subjected to direct genomic sequencing of the corresponding genes, i.e. MCPH1, WDR62, ASPM, and CENPJ, respectively. This revealed one, two, and nine novel mutations in MCPH1, WDR62, and ASPM, respectively. Genome-wide linkage analysis in the 5 families previously excluded to be linked to any of the known loci resulted in 5 different new gene loci, MCPH8-MCPH12, situated on different chromosomes. For two of the five new loci, namely MCPH8 on chromosome 7q21-q22 (LOD score 10.47) and MCPH9 on chromosome 4p14-4q12 (LOD score 2.53), the causative genes could be identified. Positional candidate gene sequencing revealed mutations in CDK6 (c.589G>A, p.A197T) at the MCPH8 locus and in CEP135 (c.970delC, p.Gln324Serfs*2) at the MCPH9 locus as the most likely pathogenic variants. These variants were not found in 768 chromosomes from healthy Pakistani controls. These two novel MCPH proteins cyclin-dependent kinase 6 (CDK6) and a centrosomal protein of 135kDa (CEP135) presented as transient or permanent components of the centrosome. Cdk6 and Cep135 showed a high expression level in the developing neuroepithelium of the mouse cerebral cortex of E11.5 and E15.5 embryos. In human cell lines, the localization of CDK6 at the spindle pole was observed. Primary fibroblasts of the patient with the CDK6 mutation failed to grow normally and showed an aberrant nuclear shape as well as centrosome-nucleus distance. CDK6 suppression by shRNA mimicked the defects in cell proliferation, nuclear shape, and microtubule organization. Likewise, overexpression of mutant CDK6 resulted in the production of multiple centrosomes and disorganised microtubules. Primary fibroblasts of the patient with the CEP135 mutation showed multiple and fragmented centrosomes, a disorganised microtubule system, misshapen and fragmented nuclei, and sometimes a complete loss of centrosomes. Altered levels of wild-type and mutant CEP135 protein by overexpression caused disorganization of microtubules, while overexpression of mutant CEP135 showed also multiple centrosomes observed before in the patient’s primary fibroblasts. Based on the data on CDK6, I propose that mutation p.A197T may lead to a reduced cell proliferation and may also affect the correct functioning of the centrosome in microtubule organisation and its positioning near the nucleus. The abnormal centrosome number associated with mutant CEP135 strengthens its role in centriole biogenesis, whereas a disorganisation of the microtubule network points to its role at the centrosome as a microtubule organising center. The data obtained lend further support to the hypothesis that the exquisite control of the cleavage furrow orientation in mammalian neural precursor cell mitosis, controlled in great part by the centrosomes and spindle poles, is critical in the etiology of MCPH (Fish et al., 2006, Thornton and Woods, 2009).

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Autosomal rezessive primäre Mikrozephalie (MCPH) ist eine seltene, genetisch bedingte Erkrankung, bei der die Betroffenen einen verringerten Kopfumfang von mindestens drei Standardabweichungen unter dem für das Alter und Geschlecht durchschnittlichen Normalwert haben. Der reduzierte Kopfumfang ist auf eine kleinere, aber architektonisch normale Hirnrinde zurückzuführen. MCPH ist durch eine ausgeprägte genetische Heterogenität gekennzeichnet. Bisher sind sieben Loci bekannt, die als MCPH1-7 bezeichnet werden. Die zugrundeliegenden genetischen Defekte wurden in den folgenden sieben Genen gefunden: MCPH1, WDR62, CDK5RAP2, CEP152, ASPM, CENPJ und STIL/SIL. Die Inzidenz dieser Erkrankung ist in Pakistan am höchsten (Woods et al., 2005). In der vorliegenden Arbeit wurden dreißig Familien mit MCPH aus verschiedenen Regionen Pakistans untersucht. Homozygotie-Kartierungen ergaben, dass die Erkrankung in 19 Familien mit dem MCPH5-Lokus, in zwei Familien mit dem MCPH2-Lokus, in zwei weiteren Familien mit dem MCPH4-Lokus, in einer Familie mit dem MCPH1-Lokus und in einer anderen Familie mit dem MCPH6 gekoppelt ist. In fünf Familen wurden alle bekannten MCPH-Loci ausgeschlossen. In den Familien, bei denen eine Kopplung mit dem MCPH1-, MCPH2-, MCPH5- oder MCPH6-Lokus vorlag, wurden die entsprechenden Gene, d. h. MCPH1 WDR62, ASPM und CENPJ, genomisch sequenziert. Dabei konnten in den Genen MCPH1, WDR62 und ASPM eine, zwei bzw. neun neue Mutationen gefunden werden. Eine genomweite Kopplungsanalyse in den 5 Familien, in denen zuvor eine Kopplung zu bekannten Loci ausgeschlossen worden war, resultierte in 5 verschiedenen neuen Loci, MCPH8-MCPH12, die sich auf verschiedenen Chromosomen befinden. Für zwei der fünf neuen Loci, MCPH8 auf Chromosom 7q21-q22 (LOD-Score 10,47) und MCPH9 auf Chromosom 4p14-4q12 (LOD-Score 2,53), konnten die ursächlichen Gene identifiziert werden. Positionelle Kandidatengensequenzierungen offenbarten Mutationen in CDK6 (c.589G> A, p.A197T, MCPH8-Lokus) und in CEP135 (c.970delC, p.Gln324Serfs*2, MCPH9-Lokus) als die jeweils wahrscheinlichsten pathogenen Varianten. Diese Varianten waren in 768 Chromosomen gesunder pakistanischer Kontrollen nicht nachweisbar. Die zu den neuen MCPH-Genen korrespondierenden Proteine, die Cyclin-abhängige Kinase 6 (CDK6) und das Zentrosomale Protein 135 kDa (CEP135), stellen vorübergehende oder dauerhafte Komponenten des Zentrosoms dar. In Mausembryonen (Stadien E11.5 und E15.5) zeigen die Proteine Cdk6 und Cep135 eine hohe Expression im sich entwickelnden Neuroepithel der Großhirnrinde. In humanen Zelllinien konnte erstmalig die Lokalisation von CDK6 am Spindelpol beobachtet werden. Primäre Fibroblasten des Patienten mit der CDK6-Mutation wuchsen sehr schlecht und zeigten eine abweichende Kernform sowie einen extremen Zentrosom-Kern-Abstand. Die CDK6-Inhibierung durch shRNA ahmte die Proliferationschwäche der Zellen, die veränderte Kernform und die gestörte Mikrotubuli-Organisation nach. Ebenso führte die Überexpression von mutiertem CDK6 zur Bildung von multiplen Zentrosomen und desorganisierten Mikrotubuli. Primäre Fibroblasten des Patienten mit der CEP135-Mutation zeigten multiple und fragmentierte Zentrosomen, ein desorganisiertes Mikrotubuli-System, deformierte und fragmentierte Kerne sowie manchmal einen vollständigen Verlust der Zentrosomen. Eine Überexpression von Wild-typ und mutiertem CEP135-Protein führte zu einer Desorganisation der Mikrotubuli, während bei der Überexpression von mutiertem CEP135 zusätzlich multiple Zentrosomen wie zuvor in den primären Fibroblasten des Patienten zu beobachten waren. Basierend auf den CDK6-Daten kann vermutet werden, dass die Mutation p.A197T zu einer verringerten Zellproliferation führt und auch die korrekte Funktion der Zentrosomen für die Mikrotubuli-Organisation und ihre Positionierung in der Nähe des Kerns beeinträchtigt ist. Die abnorme Zentrosomenzahl, die mit dem mutierten CEP135 assoziiert ist, weist auf die Rolle dieses Proteins in der Zentriol-Biogenese hin, während die Desorganisation der Mikrotubuli auf seine Rolle am Zentrosom als Mikrotubuli-organisierendes Zentrum hindeutet. Die gewonnenen Daten bestätigen erneut die Hypothese, dass die exquisite Kontrolle der Teilungsfurchenorientierung während der Mitose der neuralen Vorläuferzellen, die in starkem Maße von den Zentrosomen und den Spindelpolen kontrolliert wird, für die Ätiologie der MCPH entscheidend ist (Fish et al., 2006, Thornton and Woods, 2009). German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hussain, Muhammad Sajid mhussain@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-48611
Date:	28 February 2011
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language UNSPECIFIED English
Date of oral exam:	4 April 2011
Referee:	Name Academic Title Nürnberg, Peter Prof. Dr. Noegel, Angelika Anna Prof. Dr. Schwarz, Guenter Prof. Dr.
Funders:	Higher Education Commission (HEC) of Pakistan, German Academic Exchange Service (DAAD)
References:	Hussain MS, Nürnberg P, Noegel AA, Molecular Genetic Analysis of Autosomal Recessive Primary Microcephaly in Pakistani Kindreds. Thesis, University of Cologne , 2011.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4861