Universität zu Köln

Lange, Carolin Marianne (2012). Physiologische und biochemische Untersuchungen zu oxidativem Stress in Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Through the emergence of photosynthetic living organisms on earth millions of years ago, there was an enrichment of molecular oxygen (O2) in the atmosphere. Oxidative phosphorylation is the chemical reaction which provides the biggest amount of energy in the form of ATP for the organism. It is also the main producer for reactive oxygen species (ROS). As an aerobic soil bacterium as well as extensively used organism for amino acid production, C. glutamicum is confronted with oxidative stress in its natural environment as well as in the biotechnological application. This study is using as ROS, hydrogen peroxide (H2O2) and singlet oxygen (1O2), which can be formed by the dye Rose Bengal or sodium hypochlorite. So far, little is known about the extent of oxidative damage and the protective mechanisms in C. glutamicum. In this study it has been shown that C. glutamicum is sensitive to singlet oxygen, and that in particular, the membrane is damaged. In contrast, the DNA is well protected and C. glutamicum processes effective DNA repair mechanisms. Using qualitative and quantitative proteomics, it has been shown that mainly enzymes of glycolysis and the citric acid cycle show oxidatively modified proteins, whereas in the pentose phosphate pathway, comparatively lower number of modified proteins occurs. Using fructose bisphosphate aldolase (FBA), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and isocitrate dehydrogenase (ICDH), the influence of hydrogen peroxide (H2O2) and singlet oxygen (1O2) was studied at the biochemical level. The analyses revealed that GAPDH is sensitive to H2O2 whereas ICDH is sensitive to 1O2. Furthermore, there is a correlation between the frequency of oxidative modification, the extent of the applied stress and the reduction of the enzyme activity. A protective effect of protein-free cell extract from C. glutamicum could be identified. It has been determined, a protective effect of methionine in enzyme assays. Mycothiol deficient mutants showed a strong sensitivity opposite 1O2 derived from hypochlorite. Accordingly, particularly small molecules in the cytosol have a protective effect in C. glutamicum when enzymatic defense mechanisms are no longer sufficient.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Durch das Aufkommen photosynthetisch lebender Organismen auf der Erde vor Millionen von Jahren kam es zu einer Anreicherung der Atmosphäre mit molekularem Sauerstoff (O2). Die oxidative Phosphorylierung ist hierbei die chemische Reaktion, welche es ermöglicht, die meiste Energie in Form von ATP im Organismus bereit zu stellen. Gleichzeitig aber ist sie der Hauptproduzent für reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species – ROS), die zu Zellschäden auf verschiedenen Ebenen führen können. Als aerobes Bodenbakterium und Produzent von Aminosäuren in der Biotechnologie wird C. glutamicum sowohl in seiner natürlichen Umgebung als auch in Fermentationsprozessen mit oxidativem Stress konfrontiert. In dieser Arbeit wurden als ROS Wasserstoffperoxid (H2O2) und Singulett-Sauerstoff (1O2), welches durch den Farbstoff Rose Bengal oder Natriumhypochlorit gebildet werden kann, verwendet. Bisher ist über Art und Ausmaß der oxidativen Schädigung, sowie zu möglichen Schutzmechanismen in C. glutamicum wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass C. glutamicum sensitiv für 1O2 ist und vor allem die Membran geschädigt wird. Im Gegensatz dazu wird die DNA gut geschützt. Mittels qualitativen und quantitativen Proteomanalysen konnte gezeigt werden, dass vor allem Enzyme der Glykolyse und des Citratzyklus modifizierte Proteine bei oxidativem Stress aufweisen, wohingegen Enzyme des Pentosephosphatweges vergleichsweise wenig modifizierte Peptide zeigen. Anhand von Fructosebisphosphat-Aldolase (FBA), Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und Isocitrat-Dehydrogenase (ICDH) wurde der Einfluss von H2O2 und 1O2 auf biochemischer Ebene untersucht. Dabei zeigte sich, dass die GAPDH sensitiv gegenüber H2O2 ist, wohingegen die ICDH sensitiv gegenüber 1O2 ist. Zudem korreliert die Häufigkeit der oxidativen Modifizierung mit der Stärke des applizierten Stresses und der Verminderung der Enzymaktivität. Es konnte ein schützender Effekt des proteinfreien Zellextraktes aus C. glutamicum festgestellt werden. Zudem wurde eine schützende Wirkung von freiem Methionin in Enzymtestansätzen identifiziert. Mycothiol-defiziente Mutanten zeigten eine starke Sensitivität gegenüber 1O2 gebildet durch Hypochlorit. Demnach scheinen insbesondere niedermolekulare Substanzen im Zytosol einen schützenden Effekt in C. glutamicum zu haben, wenn die enzymatische Abwehr nicht mehr ausreicht. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Lange, Carolin Marianne CarolinLange@gmx,de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-49893
Date:	October 2012
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Oxidativer Stress German Corynebacterium glutamicum German Proteom German
Date of oral exam:	12 December 2012
Referee:	Name Academic Title Krämer, Reinhard Prof.Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4989