Universität zu Köln

Asif, Maria ORCID: 0000-0003-3578-6229 (2020). Delineating genetic underpinnings and disease pathogenesis of primary microcephaly and Filippi syndrome. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The genetic underpinnings of autosomal recessive genetic disorders have been extensively scrutinized for decades. Nevertheless, the requisites for dissecting the role of causative gene variants are indispensable for elucidation of underlying disease pathogenesis. Since thoroughgoing research has been conducted to decipher complexities of brain development, congenital microcephaly (CM) stands prominent as an immaculate model of the in utero development of the brain. The isolated form of CM — primary microcephaly (MCPH) — is a rare disorder portrayed by reduced brain size and intellectual disability. Contrarily, the syndromic form of CM has a shared genetic architecture and expounds additional roles of CM proteins in other organ systems. This study aimed to comprehend the underlying pathology of 17 families afflicted with different inherited conditions. A consanguineous Pakistani MCPH family was characterized to harbour a mutation in NUP37. The mutational consequences of this gene, along with NUP107 — mutated in syndromic microcephaly — were studied in patient derived cells to delineate the pathomechanisms. Both genes encode crucial components of the outer rings of the nuclear pore complex (NPC). Mutant proteins were discerned to be unstable and dislocated from the nuclear envelope in patient cells. Comparable mutational effects were observed on NUP160 and NUP133 — further components of the NPC. Consequently, abnormalities of the nuclear shape, chromatin organization, nucleoli as well as reduction of nuclear pore density were revealed in primary fibroblasts carrying a mutation in NUP37. My observations accentuate that the components of the NPC play a pivotal role in embryonic brain development and that a defective function of nuclear pore proteins leads to congenital microcephaly with or without associated anomalies. CM is also a prominent feature of an extremely rare disorder, Filippi syndrome (FLPIS) typically characterized by craniodigital features (syndactyly of fingers and/or toes), short stature, intellectual disability and peculiar facial gestalt. A slight variability in clinical presentation causes an allelic disorder called Filippi like syndrome (FLS). Hitherto, only CKAP2L has been biochemically characterized for unraveling disease pathogenesis of FS. In this study, mutational consequences of CSNK2B — a novel candidate gene based on two missense and a nonsense mutation identified in three unrelated cases of FS and FLS — were explored. CSNK2B encodes the β subunit of CK2, which is the master regulator of all kinases. Mutant CSNK2B showed abnormal expression at transcript as well as 2 protein level. One of the missense mutations resulted in an impaired cross talk between α and β subunits and both missense mutations compromised the kinase activity of CK2. Delving deeper into the mutational effects, two crucial pathways were mainly investigated; canonical Wnt signaling (CWS) and DNA damage response (DDR). In CWS, a compromised interaction of CK2β with two key regulators of Wnt signaling, DVL3 and β-Catenin (along with its dysregulated expression) was observed. The likely effects of β-Catenin dysregulation on Wnt and DDR related genes were traced by transcriptional profiling. Furthermore, cell cycle arrest and elevated apoptosis were observed in mutant LCLs due to delayed DDR. Additionally, whole proteome profiling demonstrated disturbed interaction of 38 proteins crucial for pivotal cellular pathways, specifically CWS. Intriguingly, whole phosphoproteome profiling revealed impaired phosphorylation of more than 300 CK2 substrates in patient LCLs, thus suggesting global mutational effects. In general, it was noticed that the impact of both missense mutations slightly differed from each other on protein level. Data suggest that mutations in CSNK2B exert pleiotropic mutational effects, thereby causing FS and FSL. In the remaining families of FS and MCPH, whole-exome sequencing and subsequent bioinformatics analyses revealed strong novel candidate genes for each of them. Taken together, this study provides novel insights into the genetic and functional bases of MCPH and FS. It lays the foundation for future genomic and therapeutic investigations for these and related disorders.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Ursachen autosomal rezessiver Erkrankungen wurden in den letzten Jahrzehnten intensiv untersucht. Daneben ist die Analyse der Funktion der auslösenden Genvarianten eine herausragende Aufgabe, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Entstehung und Entwicklung der jeweiligen Erkrankung zu verstehen. Im Zentrum unseres Interesses steht die angeborene Mikrozephalie (CM). Die autosomal rezessive primäre Mikrozephalie (MCPH), die isolierte Form der CM, ist eine seltene angeborene Erkrankung, die durch eine Störung der Gehirnentwicklung, eine reduzierte Gehirngröße und damit einhergehend einen reduzierten Kopfumfang und eine unterschiedlich stark ausgeprägte geistige Behinderung gekennzeichnet ist. Die syndromische Form der CM ist ebenfalls durch Mikrozephalie charakterisiert, es sind jedoch gleichzeitig auch andere Organsysteme betroffen. Darüber hinaus ist die Mikrozephalie für die Aufklärung der Gehirnentwicklung von erheblicher Bedeutung. Ziel dieser Arbeit war die Analyse von siebzehn pakistanischen Familien, die verschiedene erblich bedingte Erkrankungen aufwiesen. In einer blutsverwandten MCPH�Familie konnten wir eine Mutation im Gen für das Kernporenprotein NUP37 identifizieren. Die Konsequenzen dieser Mutation und einer weiteren im Gen für NUP107, die eine syndromische Mikrozephalie verursacht, wurden in Patientenzellen analysiert. NUP37 und NUP107 sind beides Komponenten des äußeren Rings des Kernporenkomplexes (NPC). Die Proteine waren instabil und nur gering mit der Kernhülle assoziiert. NUP160 und NUP133 zeigten ein ähnliches Verhalten. Eine Analyse des Zellkerns in Mutantenfibroblasten ergab Veränderungen der Kernform, der Chromatinorganisation, der Nukleoli und eine geringere Kernporendichte. Zusammengefasst kann man sagen, dass Komponenten des NPC eine entscheidende Rolle in der embryonalen Gehirnentwicklung spielen und eine Fehlfunktion von Kernporenproteinen zur angeborenen Mikrozephalie mit oder ohne assoziierten Anomalien führt. Das Filippi Syndrom (FS), eine weitere sehr seltene Erkrankung, ist ebenfalls durch CM charakterisiert und durch craniodigitale Defekte (Syndaktylie der Finger und/oder Zehen), Kleinwuchs, geistige Retardierung und eine charakteristische Gesichtsform. Das Filippi like Syndrome (FLS) ist durch eine variable Klinik gekennzeichnet. Bis jetzt waren nur 4 Mutationen in CKAP2L als Ursache für FS bekannt und untersucht. In dieser Arbeit wurde die Konsequenz von Mutationen in CSNK2B untersucht. CSKN2B ist ein neues Kandidatengen für FS und FLS, in dem zwei Missensmutationen und eine Nonsensmutation in drei unabhängigen Fällen von FS und FLS identifiziert wurden. CSKN2B kodiert für die β-Untereinheit der Proteinkinase CK2, dem Regulator aller Kinasen. Das mutierte CSNK2B zeigte eine veränderte Expression sowohl auf der Transkript- als auch auf der Proteinebene. Zudem führte eine der Missensmutationen zu einer Veränderung der Interaktion zwischen der α- und der β-Untereinheit der CK2, und beide Missensmutationen beeinträchtigten die Kinaseaktivität der CK2. Um die Effekte der Mutationen weiter zu untersuchen, wurden mit dem kanonischen Wnt-Signalweg (CWS) und dem Reparaturweg nach DNA-Schädigung (DDR) zwei wichtige Signalwege ausgewählt, die durch CK2 beeinflußt werden. Für den CWS fanden wir, dass die Interaktion von CK2β mit den zwei Schlüsselregulatoren des Wnt-Signalwegs, nämlich DVL3 und β-Catenin, gestört war zusätzlich zu deren veränderter Expression. Die Auswirkungen der β-Catenin Dysregulation auf die Wnt- and DDR-assoziierten Gene wurden durch eine Analyse der Transkriptionsprofile verfolgt. Darüber hinaus wurden bei mutierten LCLs aufgrund verzögerter DDR ein Stillstand des Zellzyklus und eine erhöhte Apoptose beobachtet. Eine Proteomanalyse zeigte eine gestörte Interaktion von 38 Proteinen an, die in zentrale zelluläre Signalwege involviert sind, insbesondere in den CWS, und eine Phosphoproteomanalyse zeigte eine Beeinträchtigung der Phosphorylierung von mehr als 300 CK2-Substraten in Patienten-LCLs. Das verweist auf globale Effekte der Mutationen. Generell konnten wir feststellen, dass beide Missensmutationen in ihren Auswirkungen geringfügig voneinander abwichen. Unsere Daten weisen darauf hin, dass Mutationen in CSNK2B pleiotrope Effekte haben und so FS und FSL verursachen. Schließlich haben wir in den verbleibenden FS- und MCPH-Familien durch Exome Sequenzierung und bioinformatische Analyse neue Kandidatengene identifiziert. Zusammenfassend haben wir mit dieser Arbeit neue Daten zu den genetischen und funktionellen Ursachen von MCPH und FS gezeigt. Sie bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen, die möglicherweise zu einer Behandlung dieser und verwandter Erkrankungen führen können. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Asif, Maria maria-bukhari@hotmail.com orcid.org/0000-0003-3578-6229 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-522834
Date:	2020
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Cologne Center for Genomics
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Microcephaly, Filippi syndrome, CSK2β, Wnt signaling English UNSPECIFIED English UNSPECIFIED English
Date of oral exam:	25 June 2020
Referee:	Name Academic Title Nürnberg, Peter Prof. Dr. Eichinger, Ludwig Prof. Dr. Roth, Siegfried Prof. Dr. Budde, Birgit Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/52283