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| Das humane MUC1-Mucin repräsentiert ein Glykoprotein, welches von den meisten epithelialen Zellen sowie einigen Lymphozyten-Spezies exprimiert wird. In vielen Karzinomgeweben kommt es zur Überexpression von MUC1, wobei das tumor-assoziierte Mucin gleichzeitig durch ein stark verändertes Glykosylierungsprofil charakterisiert wird. Diese Eigenschaften machen MUC1 zu einem wichtigen diagnostischen Tumorantigen und einer vielversprechenden Tumorvakzine bei der Therapie von Krebserkrankungen.
Es ist bekannt, dass Mucine von unterschiedlichen Organen und Geweben verschiedene Muster von O-Glykosylierungen besitzen.
Bisher konnte gezeigt werden, dass das O-Glykanprofil von MUC1 in Muttermilch durch core2-basierende, lineare oder verzweigte Polylactosaminylketten dominiert wird, welche mit bis zu drei Fucoseresten substituiert sind (Hanisch et al., 1989). Mono- und disialylierte Strukturen sind ebenfalls vorhanden, sie machen aber nur 25 % der Glykane aus (Hanisch et al., 1990).
Die Glykoformen in Krebszelllinien wie T-47D (Hanisch et al., 1996) oder anderen Brustkarzinomzelllinien (Lloyd et al., 1996) enthalten verkürzte Strukturen wie core-GalNAc, das core1-Disaccharid Gal(ß1-3)GalNAc und seine mono- und disialylierten Derivate.
Zur Untersuchung der Frage, ob es einen Zusammenhang zwischen zellulärem Trafficking und der O-Glykosylierung gibt, wurden neben dem als Referenzprotein geltenden Fusionsprotein MUC1-M zwei weitere, vom MUC1-M abgeleitete mutierte Sonden eingesetzt, wobei MUC1-M-Y20/60/N eine stark reduzierte Endozytose über Clathrin-Vesikel und MUC1-M-CQC/AQA eine eingeschränkte Rezyklisierung durch das TGN bzw. Golgi-Kompartimente zur Plasmamembran und eine entsprechend Akkumulation in Endosomen aufwiesen. Die drei Konstrukte wurden jeweils rekombinant in der embryonalen Nierenzelllinie HEK-293, den Brustkarzinom-Zelllinien MCF-7 und MDA-MB-231 exprimiert.
Im Immunoblot erfolgte der Nachweis löslichen MUC1-M Fusionsproteins, das durch Shedding in den Kulturüberstand abgegeben und über seine Peptidmarkierungen (Oligo-His und Myc) aufgereinigt bzw. detektiert werden konnte. Während die abgeschilferten Isoformen keine zytoplasmatische Domäne zeigten, wurden die exosomalen MUC1-M Sonden als heterodimäre Proteinkomplexe mit extrazellulärer und zytoplasmatischer Domäne nachgewiesen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die O-Glykosylierung membranständiger (rezyklisierender) MUC1-Glykosylierungsproben untersucht, um die gewonnenen Strukturdaten anschließend mit denen der sezernierten (nicht-rezyklisierenden) MUC1-Probe MUC1-S (Engelmann et al., 2005) zu vergleichen.
Beide Isoformen, die membranständige und die sezernierte, nutzen unterschiedliche zelluläre Glykosylierungswege, die vermutlich Einfluss auf das O -Glykosylierungsprofil der Isoformen nehmen.
Es stellte sich heraus, dass das O-Glykanprofil der beiden MUC1-M- und MUC1-M-Y20/60/N-Sonden vorrangig von einer hohen core1-Expression dominiert wurde, während eine drastische Verschiebung bei der Expression von core1 in Richtung auf core2-basierende Zuckerstrukturen bei MUC1-M-CQC/AQA und MUC1-S beobachtet werden konnte. Als erste wesentliche Erkenntnis dieser Studie ergab sich, dass ein Rezyklisierungsstop bei MUC1-M-CQC/AQA und die nur einmalige Golgi-Passage der sezernierten Isoform MUC1-S eine überwiegend core2-basierende O-Glykosylierung zur Folge hat.
Die signifikant erhöhte terminale Sialinierung der membran-gebundenen MUC1-Glykosylierungsproben MUC1-M, MUC1-M-Y20/60/N und MUC1-M-CQC/AQA wird vermutlich durch mehrfach wiederholtes endozytotisches Re-Internalisieren und Re-Zyklisieren durch die trans-Golgi-Zisterne erreicht. Dieser Mechanismus wurde für endogenes membranäres MUC1 bereits nachgewiesen.
Desweiteren lieferte die Tatsache, dass die eingeschränkte Clathrin-vermittelte Endozytose im Falle vom MUC1-M-Y20/60/N kaum zu Änderungen des Glykosylierungsprofils gegenüber der Referenzsonde MUC1-M führte, den Hinweis, dass außer Clathrin-vermittelter Endozytose weitere intrazelluläre Transportmechanismen bei der Internalisierung von MUC1 von entscheidender Bedeutung sind, die in der Lage sind, die reduzierte Clathrin-induzierte Endozytose bei MUC1-M-Y20/60/N zu kompensieren. Um einen möglichen Zusammenhang des N-Glykosylierungsstatus mit dem zellulären Trafficking des MUC1 und seinem exosomalen Export nachzuweisen, wurden die zellulären und
exosomalen N-Glykoformen der zytoplasmatischen MUC1-M-Endodomäne transfizierter HEK293-Zellen unter Einsatz von Inhibitoren der N-Glykanprozessierung untersucht.
Die unter Einsatz der Prozessierungs-Inhibitoren erzielten Ergebnisse belegen, dass die exosomale Glykoform Endo H-sensitiv und damit vom Hybrid- oder Oligomannose-Typ war, während das zelluläre (plasmamembranäre) MUC1-M Fusionsprotein Endo H-resistent, aber PNGase F-empfindlich war, was auf eine N-Glykosylierung vom komplexen Typ hinweist.
Die Ergebnisse belegen, dass die unterschiedliche N-Glykosylierung der exosomalen und zellulären MUC1-Isoformen mit unterschiedlicher endosomaler Sortierung zusammen hängen könnte. Nicht-prozessierte N-Glykoformen würden demnach entweder rezyklisieren, um durch weitere Golgi-Passagen eine N-Glykosylierung vom komplexen Typ zu generieren, oder es käme zu einer Elimination des Glykoproteins entweder über lysosomalen Abbau (in dieser Studie nicht untersucht) oder exosomalen Export.
Der N-Glykosylierungsstatus stellt womöglich ein sensitives regulatorisches System im Zusammenhang mit der Sortierung und Zielsteuerung apikaler plasmamembranständiger Proteine dar und kann somit den Transportmechanismus bestimmter Glykoproteine durch veränderte N-Glykosylierung beeinflussen.
Die Aufklärung der Endozytosewege und intrazellulären Transportrouten im Zusammenhang mit der MUC1-Rezyklisierung erfolgte immunzytologisch mittels Kolokalisationsstudien unter Einsatz verschiedener versikulärer Endozytose-Marker wie Anti-Clathrin, Anti-Caveolin-1 und Anti-Flotillin-2 mit Anti-MUC1. Die Untersuchungen in der konfokalen Lasermikroskopie wurden an drei Zelllinien durchgeführt (HEK-293, MCF7 und MDA-MB-231).
In allen drei mit MUC1-M, MUC1-M-Y20/60/N und MUC1-M-CQC/AQA transfizierten Zelllinien konnte die Existenz Clathrin-vermittelter MUC1-Endozytose bestätigt werden.
Kolokalisationsstudien mit Anti-Caveolin-1 für die Caveolin-abhängige und Raft-assoziierte Endozytose und Anti-Flotillin-2 für die Darstellung Lipid-Raft-assoziierter, Caveolin-unabhängiger Transportwege ergaben Hinweise auf die Existenz alternativer Endozytosewege des MUC1. | German |
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