Biochemische und elektrophysiologische Charakterisierung der dualen Funktion des Kanals MscCG aus Corynebacterium glutamicum

Becker, Michael (2013). Biochemische und elektrophysiologische Charakterisierung der dualen Funktion des Kanals MscCG aus Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

In their natural environment as well as under fermentation conditions in industrial biotechnology bacteria are exposed to rapid environmental changes. To cope with these changes, bacterial cells are equipped with several protective mechanisms to overcome life-threatening alterations, in particular against shifts in external osmolality. To prevent cell lysis caused by hypoosmotic downshift as a consequence of a massive influx of water, mechanosensitive channels are activated by an increased membrane tension to release compatible solutes. Corynebacterium glutamicum has been used for the industrial production of amino acids like L-glutamate since decades, whereas the export mechanism has only been poorly understood. Recently, the mechanosensitive channel MscCG was related to the production of glutamate. MscCG of C. glutamicum belongs to the MscS-family of mechanosensitive channels and plays, besides its function as emergency release for compatible solutes like glycine-betaine and proline, a role in the excretion of glutamate. The truncation of MscCG by 110 amino acids leads to spontaneous excretion of glutamate, whereas the deletion of mscCG results in a drastic decrease of the induced glutamate excretion. MscCG shows typical properties of stretch-activated mechanosensitive channels and contributes, together with the secondary active transporter BetP, to the adjustment of the internal concentration of compatible solutes which are accumulated during hypoosmotic conditions. This work provides evidence that glutamate is directly released through the channel domain of MscCG in response to penicillin treatment. GOF- as well as LOF-mutations were introduced in MscCG and enhanced or abolished the excretion of glutamate, respectively. The additional and unique C-terminal domain of MscCG seems to possess a regulatory function, without being essential for the triggered release of glutamate. However, the integrity of the fourth transmembrane domain, as well as enclosed and highly conserved segments surrounding this domain, are essential for the accurate accumulation of betaine during osmotic compensation after hypoosmotic shock.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Abstract

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In ihrer natürlichen Umgebung, sowie unter artifiziellen Bedingungen wie in der industriellen Biotechnologie sind Bakterien stetig Veränderungen ihrer Umwelt ausgesetzt. Um sich raschen Änderungen der externen Osmolalität anzupassen, besitzen Bakterien verschiedene Schutzmechanismen. Bei einem plötzlichen Abfall der externen Osmolalität wird eine Zelllyse aufgrund einströmenden Wassers durch Aktivierung mechanosensitiver Kanäle verhindert. Dabei öffnen mechanosensitive Kanäle als Folge eines Anstiegs der Membranspannung und ermöglichen die rasche Freisetzung von kompatiblen Soluten. Corynebacterium glutamicum wird seit vielen Jahrzehnten für die Produktion von Aminosäuren wie L-Glutamat eingesetzt. Ein Exportmechanismus, der für die Freisetzung von Glutamat verantwortlich ist, war jedoch lange unbekannt. Vor wenigen Jahren wurde der Export von Glutamat mit den mechanosensitiven Kanal MscCG in Verbindung gebracht. MscCG von C. glutamicum zählt zu den mechanosensitiven Kanälen der MscS-Familie und nimmt offenbar neben seiner Funktion als Notventil zur Freisetzung kompatibler Solute wie Glycin-Betain und Prolin auch eine Rolle bei der Produktion von Glutamat ein. So führt die Manipulation durch Verkürzung um 110 Aminosäuren zu einer spontanen Exkretion von Glutamat, während eine Deletion von mscCG eine ausgelöste Exkretion drastisch verringert. MscCG weist typische Eigenschaften eines Membranspannungs-abhängigen mechanosensitiven Kanals auf und ist zusammen mit dem sekundär aktiven Betain/Na+ Symporter BetP bei der Feinabstimmung der internen Solutkonzentration unter hyperosmotischen Bedingungen beteiligt. In dieser Arbeit wurde sowohl mit GOF- als auch LOF-Mutationen gezeigt, dass die Penicillin-ausgelöste Exkretion von Glutamat direkt durch den mechanosensitiven Kanal vermittelt wird. Die zusätzliche C-terminale Domäne von MscCG scheint dabei eine regulatorische, aber keine essenzielle Funktion einzunehmen, während die Integrität der vierten Transmembrandomäne, sowie flankierender Bereiche für die Akkumulation von Betain unter hyperosmotischen Bedingungen und damit der Osmoregulation als Antwort auf hyperosmotischen Stress von essenzieller Bedeutung ist.

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