Universität zu Köln

Maximov, Stanislav (2013). Analyse der physikalischen Stimuli des osmoregulierten Transporters BetP aus Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Der sekundär aktive Glycinbetaintransporter BetP aus Corynebacterium glutamicum zeichnet sich durch die Eigenschaften eines Sensors und eines Regulators aus. Sowohl in Zellen als auch in Proteoliposomen reagiert das Protein bei der Steigerung der externen Osmolalität mit Beschleunigung der Betainaufnahme. Die BetP Aktivierung in Vesikeln konnte auf die Erhöhung der internen K+ Konzentration zurückgeführt werden. Die BetP Stimulierung durch die Steigerung der cytoplasmatischen K+ Konzentration wurde ebenfalls in C. glutamicum Zellen nachgewiesen und in dieser Arbeit ausführlich untersucht. Die seit langer Zeit vermutete Interaktion von BetP mit K+ wurde mithilfe der Röntgenkristallographie bestätigt. Die Analyse der K+ bedingten BetP Aktivierung in vivo und in vitro demonstrierte, dass die Bindung von K+ an BetP einen stark kooperativen Charakter hat. Allerdings wurde durch die separate Applikation unterschiedlicher natürlicher und artifizieller BetP Stimuli (K+, hyperosmotischer Schock und amphipathische Verbindungen) in C. glutamicum-Zellen demonstriert, dass der Transporter neben des K+ assoziierten mindestens einen weiteren, K+ unabhängigen Stimulus perzipieren muss, um die maximale Betainimportrate in vivo zu erreichen. Der alternative Stimulus ist wahrscheinlich mit der Veränderung der physikalischen Parameter der Membran (z.B. des lateralen Membrandrucks) assoziiert. Letzterer BetP Stimulus wurde bei früheren Untersuchungen in Proteoliposomen nicht beobachtet. Dies warf die Frage nach dem Aktivierungszustand des Carrierproteins in Vesikeln auf. Um diese Frage zu beantworten, wurde die molekulare BetP Aktivität in Zellen und in Vesikeln verglichen. Die immunologische Bestimmung der BetP Konzentration in Zellextrakten von E. coli sowie die Aktivitätstitration zur Abschätzung des Anteils der aktiven BetP Moleküle in Proteoliposomen ermöglichte die Berechnung der Wechselzahl von BetP in vivo und in vitro. Die molekulare Aktivität von BetP in Proteoliposomen war mit der in Zellen bei voller Stimulierung vergleichbar. Außerdem war die Wirkung der amphipathischen Verbindung Tetracain auf das Aktivierungspofil von BetP in Proteoliposomen und in C. glutamicum Zellen bei hyperosmotischen Bedingungen sehr ähnlich. Demzufolge hat BetP in vitro maximale Transportaktivität, was wiederum bedeutet, dass der alternative, K+ unabhängige Stimulus in Vesikeln permanent wirksam ist.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language The secondary active glycine betaine transporter BetP of Corynebacterium glutamicum comprises also functions of a sensor and a regulator. In both cells and proteoliposomes the protein responds to elevation of the external osmolality with an increased transport rate. The activation of BetP in vesicles could be attributed to the increase of the internal K+ concentration. Also in intact cells BetP was found to be stimulated by the rise of the cytoplasmic K+ level. The presumed interaction of BetP and K+ was confirmed by X ray crystallography and the study of the K+ related activation of BetP demonstrated that the binding of K+ to BetP occurs in a strongly cooperative manner. However, the separate application of both natural and artificial BetP activators (K+, hyperosmotic shock and amphipathic compounds) in C. glutamicum cells demonstrates that besides the K+ associated one BetP perceives at least one additional Stimulus (K+ independent) to reach the maximal transport activity. The alternative stimulus of BetP is probably associated with an alteration of physical parameters of the plasma membrane (e.g. lateral membrane pressure). Due to the fact that the latter stimulus was not observed in proteoliposomes in previous experiments, the question about the activation state of reconstituted BetP was raised. To study this question BetP activity was analysed in cells and vesicles. The immunologic determination of BetP concentration in cell extracts of E. coli cells and as well as a newly developed technique for estimation of the percentage of active reconstituted BetP allowed calculation of the turnover number of BetP in vivo and in vitro. The molecular activity of BetP in both systems was comparable. Also the effect of the amphipath tetracaine on the activation profile of BetP in proteoliposomes was closely similar to the activation profile of BetP in cells exposed to hyperosmotic stress. Consequently, we conclude that BetP is fully active in proteoliposomes, which in turn means that the alternative K+ independent Stimulus is effective in vesicles. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Maximov, Stanislav st.maximov@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-53123
Date:	2013
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Corynebacterium glutamicum German BetP German Osmoregulation German Proteoliposomen German Transport German
Date of oral exam:	2 July 2013
Referee:	Name Academic Title Krämer, Reinhard Prof. Dr. Flügge, Ulf-Ingo Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5312