Universität zu Köln

Kroef, Virginia ORCID: 0000-0003-3695-911X (2021). Chemical mutagenesis screen identifies AMDHD2 as a critical regulator of the hexosamine biosynthetic pathway. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Aging is associated with a variety of common disorders such as cancer, diabetes, neurodegenerative, or cardiovascular diseases. Consequently, the steady expansion of the older population raises a dramatic global concern regarding health issues. The aging process is accompanied by multiple metabolic changes which contribute to the physiological decline and manipulation of relevant pathways is sufficient to extend lifespan. Therefore, it is critical to further elucidate how nutrient signaling is interconnected to the metabolic regulation of aging and thereby identify novel druggable targets. The hexosamine biosynthetic pathway (HBP) is a nutrient-sensing pathway that consumes fructose, glutamine, acetyl CoA, and UTP to generate UDP-GlcNAc, an essential precursor for post-translational protein glycosylation. Thus, the HBP is optimally positioned to integrate signals from diverse metabolic pathways and its manipulation is likely to influence the overall metabolic state. The HBP is controlled by its rate-limiting enzyme glutamine fructose 6 phosphate amidotransferase (GFAT) that is feedback inhibited by UDP-GlcNAc. While HBP regulation by GFAT is well-studied, other HBP regulators remain obscure. Elevated UDP GlcNAc levels can counteract toxicity induced by tunicamycin (TM), a potent glycosylation inhibitor. Therefore, TM resistance is a suitable proxy for elevated UDP-GlcNAc levels and thus, HBP activity. In order to identify novel regulators of the HBP, we performed an unbiased TM resistance screen in haploid mouse embryonic stem cells (mESCs) using random chemical mutagenesis. We identified multiple loss-of-function mutations in the enzyme N acetylglucosamine deacetylase (AMDHD2) that catalyzes a reverse reaction in the HBP. By solving the crystal structure of human AMDHD2, we found that loss of function is caused by impaired protein stability and catalytic activity. Finally, we showed that AN3-12 mESCs express AMDHD2 together with GFAT2 instead of the more common GFAT1. GFAT2 is less susceptible to UDP GlcNAc inhibition compared to GFAT1, explaining how loss of AMDHD2 elevates HBP flux. This specialized HBP configuration, characterized by co expression of AMDHD2 and GFAT2, was also observed in other mESCs. Consistently, we confirmed a decreased GFAT2:GFAT1 ratio upon differentiation of mouse and human ESCs. The relevance of this specific HBP regulation for ESC fate decisions was reinforced by embryonic lethality of homozygous AMDHD2 K.O. mice. Together, this work reveals a critical function of AMDHD2 in balancing UDP GlcNAc levels in cells that use GFAT2 for metabolite entry into the HBP, which potentially serves as a metabolic adaptation for distinct nutrient requirements. Overall, the crucial role for AMDHD2 in HBP regulation offers novel approaches for the development of therapeutic agents to tackle age-related diseases.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Das Altern ist mit einer Vielzahl von Volkskrankheiten verbunden wie Krebs, Diabetes, neurodegenerativen oder kardiovaskulären Erkrankungen. Folglich stellt der stetig zunehmende Anteil an älteren Menschen ein dramatisches weltweites Gesundheitsproblem dar. Der Alterungsprozess wird von zahlreichen metabolischen Veränderungen begleitet, die zum physiologischen Verfall beitragen und eine Manipulation der relevanten Stoffwechselwege reicht aus, um die Lebensspanne zu verlängern. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, tiefgehender aufzuklären, wie die Nährstoffsignalübertragung mit der metabolischen Regulation des Alterns zusammenhängt, um dadurch neue Angriffspunkte für die Entwicklung von Medikamenten zu identifizieren. Der Hexosamin-Biosyntheseweg (HBW) ist ein nährstoffsensitiver Stoffwechselweg, der Fruktose, Glutamin, Acetyl-CoA und UTP verbraucht, um UDP-GlcNAc zu erzeugen, ein essentielles Vorprodukt für die posttranslationale Proteinglykosylierung. Somit ist der HBW optimal positioniert, um Signale aus verschiedenen Stoffwechselwegen zu vernetzen und seine Manipulation kann wahrscheinlich den gesamten Stoffwechselzustand beeinflussen. Der HBW wird durch sein Reaktionsgeschwindigkeit-bestimmende Enzym Glutamin Fruktose-6-Phosphat-Amidotransferase (GFAT) kontrolliert, das durch UDP GlcNAc rückkoppelnd gehemmt wird. Während die HBW-Regulation durch GFAT gut untersucht ist, bleiben andere HBW-Regulatoren unerforscht. Erhöhte UDP-GlcNAc-Spiegel können der durch Tunicamycin (TM), einem potenten Glykosylierungsinhibitor, ausgelösten Toxizität entgegenwirken. Daher ist eine TM Resistenz ein geeigneter Indikator für erhöhte UDP GlcNAc-Spiegel und damit für die HBW-Aktivität. Um neue Regulatoren des HBW zu identifizieren, haben wir einen unvoreingenommenen TM-Resistenz-Screen in haploiden murinen embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) mittels chemischer Zufallsmutagenese durchgeführt. Wir konnten mehrere Mutationen identifizieren, die zu einem Funktionsverlust in dem Enzym N Acetylglukosamin Deazetylase (AMDHD2) führen, welches eine Rückreaktion im HBW katalysiert. Durch die Auflösung der Kristallstruktur des humanen AMDHD2 fanden wir heraus, dass der Funktionsverlust durch eine beeinträchtigte Proteinstabilität und reduzierte katalytische Aktivität verursacht wird. Schließlich konnten wir zeigen, dass AN3-12 mES-Zellen AMDHD2 zusammen mit GFAT2 anstelle des häufiger vorkommenden GFAT1 exprimieren. GFAT2 ist im Vergleich zu GFAT1 weniger anfällig für eine UDP GlcNAc Inhibition, was erklärt, wie der Verlust von AMDHD2 die HBW-Aktivität erhöht. Diese spezialisierte HBW-Konfiguration, charakterisiert durch die Koexpression von AMDHD2 und GFAT2, wurde auch in anderen mES-Zellen beobachtet. Übereinstimmend konnten wir ein vermindertes GFAT2:GFAT1-Verhältnis während der Differenzierung von murinen und humanen ES-Zellen zeigen. Die Relevanz dieser spezifischen HBW-Regulation für die Schicksalsentscheidungen von ES-Zellen wurde durch die embryonale Letalität von homozygoten AMDHD2 K.O.-Mäusen verstärkt. Zusammenfassend verdeutlicht diese Arbeit eine kritische Funktion von AMDHD2 beim Aufrechterhalten der UDP-GlcNAc-Spiegel in Zellen, die GFAT2 für den Metabolit-Eintritt in die HBW verwenden, was möglicherweise als metabolische Anpassung an unterschiedliche Nährstoffanforderungen dient. Insgesamt bietet die wesentliche Rolle von AMDHD2 bei der HBW-Regulation neue Ansätze für die Entwicklung von Therapeutika zur Bekämpfung altersbedingter Krankheiten. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Kroef, Virginia vkroef@smail.uni-koeln.de orcid.org/0000-0003-3695-911X UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-538090
Date:	2021
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Biology of Ageing
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Hexosamine biosynthetic pathway English Stem cell metabolism English AMDHD2 English
Date of oral exam:	1 September 2021
Referee:	Name Academic Title Denzel, Martin S. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/53809