Universität zu Köln

Bischoff, Nils (2013). Vergleichende Strukturanalyse zweier paraloger Isoformen der humanen Proteinkinase CK2 alpha. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Human protein kinase CK2 (formerly known as casein kinase 2) is a ubiquitous and highly conserved Ser/Thr kinase which is composed of a central dimer of two noncatalytic subunits CK2beta and two catalytic subunits CK2alpha. CK2 is important in cell proliferation and apoptosis and this is the reason why an elevated CK2 expression contributes cancer. In human, two paralog isoforms of the catalytic subunit (called CK2alpha and CK2alpha') exist, which differ in their C-terminal regions and show a different expression profile. While the CK2alpha isoform is well characterized in vitro and in vivo, little is known about the biochemical and structural properties of the CK2alpha' isoform. To overcome this limited knowledge, a full length mutant of human CK2alpha' was used. This study shows that the CK2alpha' mutant is well soluble and catalytically active, with an affinity 12 times lower and less driven by enthalpy to CK2beta than that of CK2alpha to CK2beta. To detect structural differences and conspicuous features between the isoforms, crystal structures of CK2alpha' and CK2alpha with two potent ATP-competitive inhibitors 3-(4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzotriazol-1-yl)propan-1-ol (MB002) and 4-(6,8-Dichloro-3-hydroxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-benzoicacid (FLC21) were solved. The present work shows for each of the CK2alpha isoforms one crystal structure in complex with MB002 and two in complex with FLC21. The results indicate a constantly open beta4/beta5 loop at the CK2alpha/CK2beta binding site of CK2alpha', in contrast to a dynamic beta4/beta5 loop in CK2alpha, which can adopt two distinct conformations, an open and a closed one. The constantly open beta4/beta5 loop of CK2alpha' is fixed by an additional parallel beta-strand at the N-terminal side of the beta4/beta5 loop, which is absent in the most structures of CK2alpha. Further a tryptophan residue fills a conserved hydrophobic pocket to a lower position in CK2alpha' than in CK2alpha. Moreover the interdomain hinge shows in all structures of CK2alpha' an open and fully functional conformation while monomeric CK2alpha adopts also a closed and unproductive conformation. Besides this study shows a disagreement of CK2alpha and CK2alpha' to the spine concept of active protein kinases, which postulates two fully constructed stacks of hydrophobic residues called catalytic and regulatory spine. CK2alpha' posses with the open interdomain hinge exclusivly an incomplete catalytic spine, but CK2alpha exhibits an incomplete catalytic spine as well as a complete catalytic spine, addicted to the conformation of the interdomain hinge. After all the CK2alpha isoforms appear enzymatic activity with an incomplete catalytic spine, based on the hypothesis that the open interdomain hinge represents the active conformation. The binding mode of the ATP-competitive inhbitor FLC21 is identical in both CK2alpha isoforms and stabilizes in each case the open interdomain hinge conformation, however MB002 does not influence the hinge region and binds in two different manners, depending on whether the interdomain hinge exists in the open or in the closed conformation. In addition FLC21 stabilizes CK2alpha and CK2alpha' in an inactive conformation which were found only in one CK2alpha structure so far. The inactivation is a result of a collapsed ATP-binding loop so that Arg47 (respectively Arg48 in CK2alpha') occupies the ribose region of the ATP site and blocks the entrance of the ATP-binding pocket.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die humane Proteinkinase CK2 (früher bekannt als Casein Kinase 2) ist eine ubiquitär vorkommende und hoch konservierte Ser/Thr Kinase die aus einem zentralen Dimer aus zwei nichtkatalytischen Untereinheiten (CK2beta) und zwei katalytischen Untereinheiten (CK2alpha) besteht. CK2 spielt eine entscheidende Rolle in Zellteilung und Apoptose, weshalb eine erhöhte CK2 Expression zu Krebs führen kann. Im Menschen existieren zwei paraloge Isoformen der katalytischen Untereinheit (CK2alpha und CK2alpha' genannt), welche sich im C-terminalen Bereich und im Expressionsprofil unterscheiden. Während die CK2alpha in vitro und in vivo gut charakterisiert ist, ist über die biochemischen und strukturellen Eigenschaften der CK2alpha' Isoform wenig bekannt. Um mehr über die CK2alpha' zu erfahren, wird in dieser Arbeit eine gut lösliche, katalytisch aktive Volllängen Mutante der menschlichen CK2alpha' vorgestellt, welche eine 12-mal geringere Affinität und weniger durch Enthalpie beeinflusste Bindung zur CK2beta hat, als die CK2alpha zur CK2beta. Um strukturelle Unterschiede und Auffälligkeiten zwischen den beiden Isoformen aufzuklären, wurden Kristallstrukturen von CK2alpha' und CK2alpha mit zwei potenten ATP-kompetitiven Inhibitoren 3-(4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzotriazol-1-yl)propan-1-ol (MB002) and 4-(6,8-Dichloro-3-hydroxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-benzoicacid (FLC21) aufgeklärt. Die vorliegende Arbeit zeigt für jede der beiden CK2alpha Isoformen jeweils eine Kristallstruktur in Komplex mit MB002 und zwei in Komplex mit FLC21. Die Ergebnisse offenbaren eine ständig geöffnete beta4/beta5 Schleife der CK2alpha' an der CK2alpha/CK2beta Bindetasche der CK2alpha', ganz im Gegensatz zu einer dynamischen beta4/beta5 Schleife der CK2alpha, welche zwei verschiedene Konformationen annehmen kann, eine offene und eine geschlossene. Die konstant geöffnete beta4/beta5 Schleife von CK2alpha' wird fixiert durch einen zusätzlichen beta-Strang an der N-terminalen Seite der beta4/beta5 Schleife, welcher in den meisten CK2alpha Strukturen nicht ausgebildet wird. Weiter füllt ein Tryptophan eine konservierte hydrophobe Tasche zu einer etwas tiefer liegenden Position in CK2alpha' aus, als es in CK2alpha der Fall ist. Zusätzlich bildet die Gelenkregion in allen Strukturen der CK2alpha' eine offene und voll aktive Konformation aus, während die Monomere CK2alpha sowohl eine geschlossene als auch eine offene Konformation annehmen können. Außerdem zeigt diese Arbeit eine Unstimmigkeit der CK2alpha und CK2alpha' in Bezug auf das Spine Konzept für aktive Proteinkinasen, welches zwei voll ausgebildete hydrophobe Stapel, katalytischer Spine und regulatorischer Spine genannt, postuliert. CK2alpha' besitzt mit einer offenen Gelenkregion ausschließlich einen unvollständigen katalytischen Spine, wohingegen CK2alpha sowohl einen unvollständigen als auch einen vollständigen katalytischen Spine aufweist, abhängig von der Konformation der Gelenkregion. Nach alledem scheinen beide CK2alpha Isoformen katalytische Aktivität mit einem unvollständigen katalytischen Spine zu besitzen, wenn man die Hypothese zu Grunde legt, dass die offene Gelenkregion die aktive Konformation repräsentiert. Der ATP-kompetitive Inhibitor FLC21 bindet in beiden CK2alpha Isoformen in der selben Art und Weise und stabilisiert die Gelenkregion in der offene Konformation, MB002 hingegen nimmt keinen Einfluss auf die Gelenkregion und bindet in zwei unterschiedlichen Weisen, abhängig davon ob die Gelenkregion in der offenen oder in der geschlossenen Konformation vorliegt. Zusätzlich stabilisiert FLC21 CK2alpha und CK2alpha' in einer inaktiven Konformation, welche bislang erst in einer CK2alpha Struktur gefunden wurde. Die Inaktivierung ist Resultat einer kollabierten ATP-bindenden Schleife, so dass Arg47 (bzw. Arg48 in CK2alpha') die Riboseregion der ATP-Bindestelle besetzt und so den Zugang zur ATP-Bindetasche blockiert. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bischoff, Nils nils.bischoff@outlook.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-53960
Date:	21 May 2013
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Eukaryotic protein kinases, Protein kinase CK2, Paralog isoforms of human CK2alpha, Kinase-inhibitors, X-ray crystallography, spine-concept English
Date of oral exam:	8 July 2013
Referee:	Name Academic Title Niefind, Karsten Prof. Dr. Schwarz, Günter Prof. Dr. Mathur, Sanjay Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5396