Universität zu Köln

Storbeck, Markus (2013). Characterization of Neuronal-Specific Tra2b Knock-Out Mice and Identification of Tra2b Splicing Targets. PhD thesis, Uniklinik Köln, Institut für Humangenetik.

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Abstract

TRA2B is a serine-arginine-rich splicing factor that contributes to the alternative splicing of exons and depletion of Tra2b in the mouse causes early embryonic lethality. It modulates splice site selection in a concentration dependent fashion and associates to target exons either directly via GAA binding motifs or indirectly via interactions with other splice factors. TRA2B is highest expressed in neuronal tissue and testis and its expression and activation are controlled via an autoregulatory self-splicing mechanism and by phosphorylation. Depending on interactors and on the position of binding, TRA2B can promote either inclusion or skipping of exons. TRA2B has been associated with splicing processes involved in development, vascularization, spermatogenesis and neuronal function and deregulation of splicing processes has been linked to conditions like Alzheimer’s disease, dementia and Parkinson’s disease. Importantly, TRA2B is involved in the splicing of the SMN transcript and has been demonstrated to promote inclusion of exon 7. The functional loss of the SMN1 gene causes spinal muscular atrophy, whereas the copy number of SMN2, which is alternatively spliced to mainly block exon 7 inclusion, is the major determinant of the disease severity. Correction of the SMN2 splicing pattern to increase the number of functional full-length transcripts is a promising avenue for SMA therapy. The use of HDAC inhibitors like VPA has been demonstrated to correct the SMN2 splicing pattern to a great extent by transcriptional upregulation of TRA2B. Despite promising trial of VPA in SMA therapy and successful application in other conditions like epilepsy and bipolar disorder, it can be assumed that the splicing of other transcripts targeted by TRA2B besides SMN2 will be affected by its upregulation. In the present work a neuronal-specific Tra2b knock-out mouse was generated to identify transcripts targeted by Tra2b in the central nervous system. Mice homozygously depleted of Tra2b in the central nervous system died shortly after birth and presented severe abnormalities in cortical development. These included a loss of cortical patterning, a reduction of the total cortical width and ventriculomegaly. By immunohistochemical analyses of brain sections at developmental stages reaching from 14.5 dpc to birth, massive apoptosis was detected in the ventricular and subventricular layers of the lateral ventricles and in the thalamic region. Apoptosis at 14.5 dpc was followed by a loss of the proliferative potential in a timely fashion, which caused a progressive loss of cortical material and ventricular dilation that reached its end stage at 16-17 dpc. Based on a mosaic knock-out of Tra2b in the murine brain, mRNA and protein levels of Tra2b were drastically reduced, but not fully absent as demonstrated by quantitative PCR and semi-quantitative Western Blot. Heterozygous knock-out animals were fully viable, showed no apoptosis, normal brain development and Tra2b protein levels comparable to control mice. Analysis of Tra2b isoforms revealed that the autoregulatory splicing feedback-loop of Tra2b is functional in vivo in the mouse brain and compensates for the loss of a single gene copy by upregulation of functional Tra2b transcripts due to skipping of exon 2. By the use of quantitative PCR, previously and in minigene approaches identified Tra2b-dependent splicing processes of Mapt, Cltb, Tra2a and Nasp were indentified in vivo providing proof of concept for the identification of splicing processes in the Tra2b-deficient murine brain. For the in vivo identification of novel Tra2b target exons, whole transcriptome sequencing and mouse exon array analysis were performed using whole brain RNA from neuronal-specific knock-out mice. Based on dramatic differences between control and knock-out brains and drastically altered cellular compositions, the reliable identification of targeted exons proved to be difficult. Exons of the Shugoshin-like 2 and Tubulin delta chain were identified via exon array analysis to be promoted by Tra2b in vivo. These splicing processes were confirmed by quantitative PCR and both identified exons were shown to be responsive to increased Tra2b concentrations in a minigene splicing assay. Some of the in vivo identified Tra2b-dependent splicing processes have possible implications in neuronal development and function, and might therefore contribute to the observed aberrations in brain development. Moreover, the cell cycle regulating gene Cdkn1a (encoding p21) was found upregulated in brains of neuronal-specific knock-out mice using exon arrays, and p21 upregulation was validated by quantitative PCR. P21 is a well-known inhibitor of cell cycle progression that causes cells to enter cell cycle arrest at the G1-S-phase transition. RNAi-mediated depletion of Tra2b in NSC34 neuronal precursor cells caused a drastic increase of p21 expression on RNA and on protein level. Strikingly, NSC34 cells died shortly after p21 expression had increased, indicating an apoptotic effect. This suggests that an increased p21 expression is likely the reason for apoptosis and the loss of the proliferative potential in neurogenic areas of the developing Tra2b-depleted brains. Previous studies have linked deficiency of the histone chaperone Nasp to upregulation of p21 and to apoptosis. Further investigations need to clarify, whether Tra2b-related missplicing of Nasp (tNasp depletion) is the underlying reason for p21 upregulation and apoptosis.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Charakterisierung von neuronal-spezifischen Tra2b-deletierten Mäusen und Identifizierung von Tra2b-gespleißten Exons German
Translated abstract:	Abstract Language TRA2B ist ein SR-related Spleißfaktor, der das alternative Spleißen von Exonen reguliert und die Abwesenheit von TRA2B führt zu früher embryonaler Lethalität in Mäusen. TRA2B moduliert die Auswahl von Spleißstellen in Abhängigkeit von seiner Konzentration. Dabei assoziiert TRA2B entweder direkt über GAA Bindestellen mit seinem Zielexon oder es bindet indirekt durch Interaktion mit anderen Speißfaktoren. TRA2B wird am stärksten in neuronalem Gewebe und in Testis exprimiert, während die Expression selbst sowie der Aktivierungszustand über einen sich selbst regulierenden auto-Speißmechanismus und durch Phosphorylierung gesteuert werden. In Abhängigkeit von seinen Interaktionspartnern und der Bindestelle innerhalb eines Transkripts kann TRA2B entweder den Ein- oder Auschluss eines Exons fördern. TRA2B wurde in vorhergegangenen Studien mit Spleißprozessen in Verbindung gebracht, welche für die Entwicklung, Vaskularisierung, Spermatogenese und neuronale Funktion von Bedeutung sind. Störungen in TRA2B-abhängigen Spleißprozessen wurden in Krankheiten wie Alzheimer, Demenz und Parkinson nachgewiesen. Von hoher Bedeutung ist der Einfluss von TRA2B auf das Spleißen von SMN Exon 7. Der funktionelle Verlust des SMN1 Gens verursacht spinale Muskelatrophie, wobei die Kopienanzahl des nahezu identischen SMN2 Gens den Schweregrad der Erkrankung bestimmt. Durch alternatives Spleißen kommt es zum Ausschluss von Exon 7 des SMN2 Gens in 90 % aller Transkripte. Die Wiederherstellung des SMN2 Spleißmusters und die damit verbundene Vervielfachung von SMN2 Volllängentranskripten bietet deshalb einen vielversprechenden Therapieansatz für die SMA. Vorhergegangene Studien haben gezeigt, dass HDAC Inhibitoren wie VPA das SMN2 Spleißmuster über eine transkriptionelle Heraufregulation von TRA2B zu revertieren vermögen. VPA wurde in klinischen Studien für eine mögliche SMA Therapie getestet und VPA wird erfolgreich bei Epilepsie und bipolaren Störungen eingesetzt. Es kann jedoch davon ausgegangen werden, dass die transkriptionelle Verstärkung der TRA2B Expression neben SMN2 das Spleißen von anderen Transkripten beeinflusst. Im Rahmen dieser Studie wurden neuronal-spezifische Tra2b Knock-out Mäuse generiert, um von Tra2b regulierte Transkripte im zentralen Nervensystem zu identifizieren. Mäuse mit homozygoter Tra2b Deletion im zentralen Nervensystem starben kurz nach der Geburt und zeigten schwerwiegende Fehlbildungen des Gehirns. Diese äußerten sich insbesondere durch den Verlust der Organisation der cortikalen Laminierung, einer Reduzierung der cortikalen Dicke und Ventrikulomegalie. Durch immunhistochemische Analysen von Dünnschnitten des Gehirns beginnend bei 14.5 dpc bis zur Geburt, konnte in den ventrikulären und subventrikulären Schichten der lateralen Ventrikel sowie in der Thalamusregion Apoptose nachgewiesen werden. Apoptose wurde erstmals bei 14.5 dpc beobachtet und wurde gefolgt von ausbleibender Proliferation, was einen fortschreitenden Verlust von cortikalem Material und die Erweiterung der lateralen und des dritten Ventrikels zur Folge hatte. Diese erreichten bei 16-17 dpc ihr Endstadium. Basierend auf einem mosaischen Knock-out von Tra2b im murinen Gehirn, waren mRNA- und Proteinspiegel von Tra2b zwar drastisch reduziert, aber noch immer nachweisbar. Heterozygot deletierte Mäuse waren uneingeschränkt lebensfähig und zeigten eine normale Gehirnentwicklung, die von Kontrolltieren nicht unterscheidbar war. Durch qPCR Analyse der Tra2b isoformen konnte der zuvor beschriebene Selbstspleißmechanismus von Tra2b funktionell in vivo nachgewiesen werden. Durch einen verstärkten Ausschluss von Tra2b Exon 2 wurde der Verlust einer Tra2b Genkopie nahezu vollständig kompensiert. Durch isoformspezifische qPCRs konnten zuvor identifizierte Tra2b-abhängige Spleißprozesse von Mapt, Cltb, Tra2a und Nasp in vivo nachgewiesen werden. So konnte im Allgemeinen die Möglichkeit zur Identifizierung von Tra2b-abhängigen Spleißprozessen in konditionalen Knock-out Mäusen bewiesen werden. Zur Identifizierung unbekannter Tra2b-abhängiger Spleißprozesse wurden whole transcriptome sequencing und Exon Array Analysen mit Gehirn-RNA durchgeführt. Aufgrund der dramatischen Störungen während der Gehirnentwicklung, war die zelluläre Komposition der Gehirne insoweit verändert, sodass eine zuverlässige Identifizierung alternativ gespleißter Exone sich als schwierig erwies. Dennoch konnten Exone der Gene Shugoshin-like 2 und Tubulin delta chain in vivo identifiziert werden. Die entsprechenden Spleißprozesse wurden durch qPCR Analysen bestätigt und Minigenkonstrukte beider Exone zeigten gesteigerte Einschlussraten bei erhöhten Tra2b Konzentrationen. Einige der in vivo identifizierten Tra2b-abhängigen Spleißvorgänge sind in Prozessen der neuronalen Entwicklung involviert und könnten entscheidend zu den beobachteten Fehlbildungen des Gehirns beigetragen haben. Des Weiteren wurde durch Exon Array Analysen eine Heraufregulation des Zellzyklusregulators Cdkn1a (p21) in Tra2b Knock-out Gehirnen nachgewiesen und durch qPCR validiert. P21 ist ein etablierter Zellzyklusinhibitor, der eine Unterbrechung des Zellzyklus im Übergang von der G1- zur S-Phase auslösen kann. RNAi-vermittelte Herunterregulation von Tra2b in NSC34 neuronalen Vorläuferzellen verursachte eine drastische Erhöhung der p21 Expression auf mRNA und auf Proteinebene. Verblüffenderweise starben die meisten NSC34 Zellen kurz nach der Heraufregulation von p21, was auf einen apoptotischen Effekt schließen lässt. Das legt die Vermutung nahe, dass Apoptose und der Verlust proliferativer Aktivität, wie es in neuronal-spezifischen Knock-out Mäusen auftritt, in der in vivo erhöhten p21 Expression begründet ist. In vorhergegangenen Studien war die Defizienz des Histonchaperons Nasp mit der Heraufregulation von p21 und Apoptose in Verbindung gebracht worden. Es sollte daher in zukünftigen Studien geklärt werden, ob Tra2b-vermitteltes Fehlspleißen von Nasp (Verminderung von tNasp) die Ursache für eine Erhöhung der p21 Expression ist. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Storbeck, Markus UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-54729
Date:	14 November 2013
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Tra2b, SFRS10, RS-rich, splicing, p21, CDKN1A, SGOL2, TUBD1, MAPT, CLTB, NASP, TRA2A, neuronal development, Nestin-Cre English
Date of oral exam:	20 January 2014
Referee:	Name Academic Title Wirth, Brunhilde Prof. Dr. Rugarli, Elena Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5472