Universität zu Köln

Bender, Niklas (2022). Spatio-temporal analysis of extracellular DNA in bacterial colonies - Dynamics of penetration, uptake and transformation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Bacteria spend most of their life in surface-associated, multicellular communities called biofilms. Within biofilms, bacteria embed themselves in a matrix of self-produced extracellular components, which protects them from deleterious components like antibiotics and provides a scaffold for extensive cell-to-cell interactions. One of the key components of the biofilm matrix is extracellular DNA, which is a critical structural element, as well as a connective linker between individual cells. There is a common consensus that abundant DNA, coupled with extensive cell-to-cell interactions within biofilms, facilitates horizontal gene transfer, the exchange of mobile genetic material between genetically distinct organisms. However, this assumption is not always critically questioned and many of the biological roles of extracellular DNA, as well as horizontal gene transfer within bacterial biofilms, are still poorly understood. In this thesis we characterized the dynamics of penetration, uptake, and transformation of external DNA in microcolonies of the naturally competent human pathogen Neisseria gonorrhoeae with spatial and temporal resolution. Utilizing fluorescently labelled DNA probes, we found that penetration and retention of extracellular DNA within bacterial colonies depends on the length of the penetrating nucleotide and on specific binding of DNA to bacteria by the DNA uptake sequence (DUS). In particular, we find that the speed of penetration decreases as a function of DNA length. Yet, even genomic DNA of other species lacking the DUS reach the center of the colonies within few hours. Gonococcal genomic DNA, in which DUS are abundant, binds efficiently to the periphery of the colony but does not enter the colony center. We relate our understanding of the penetration dynamics to DNA uptake and transformation. To this end, we devised experimental assays that allowed the detection of both processes in the presence of external DNA. We show that transformation efficiencies depend on the length of transforming DNA and on the position of transforming cells within the cell aggregate. Specifically, we find that uptake and transformation are both limited to the outer periphery of colonies, which suggests that cells in the colony center feature restricted or limited competence. Finally, we investigate DNAs putative role as a structural element of the biofilms matrix by staining free DNA with a cell impermeable DNA-stain. In doing so, we find that DNA forms a mesh, or network, of DNA filaments in gonococcal cell aggregates. Dissolution of the DNA mesh affects colony architecture and morphology, suggesting that DNA is, indeed, an important connective linker in bacterial colonies. Combined, our findings show that extracellular DNA is abundant even in young colonies and that gonococcal DNA rapidly forms a network spanning large parts of the colonies. Moreover, external DNA readily penetrates the bacterial cell aggregates. Yet, transformation remains limited to the outer periphery of colonies, which raises doubts about the idea of biofilms as hot spots for gene transfer. It will be important to find out, by which mechanism competence for transformation is inhibited within colonies and bacterial biofilms.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Bakterien verbringen die meiste Zeit ihres Lebens in oberflächenassoziierten, mehrzelligen Gemeinschaften die als Biofilme bezeichnet werden. Innerhalb von Biofilmen betten sie sich in eine Matrix aus selbst produzierten extrazellulären Komponenten ein, die sie vor schädlichen Komponenten wie Antibiotika schützt und ein Gerüst für umfangreiche Zell-Zell-Interaktionen bietet. Eine der Schlüsselkomponenten der Biofilmmatrix ist extrazelluläre DNA, die ein wichtiges Strukturelement und Bindeglied zwischen einzelnen Zellen darstellt. Es herrscht ein allgemeiner Konsens darüber, dass große Mengen an verfügbarer DNA in Verbindung mit umfangreichen Zell-Zell-Interaktionen in Biofilmen den horizontalen Gentransfer, den Austausch von mobilem genetischem Material, zwischen genetisch unterschiedlichen Organismen, fördert. Diese Annahme wird jedoch nicht immer kritisch hinterfragt und viele der biologischen Zusammenhänge von extrazellulärer DNA sowie des horizontalen Gentransfers innerhalb bakterieller Biofilme sind noch immer unzureichend aufgeklärt. In dieser Arbeit haben wir die Dynamik der Penetration, Aufnahme sowie Transformation externer DNA in Mikrokolonien des natürlich kompetenten Humanpathogens Neisseria gonorrhoeae mit räumlicher und zeitlicher Auflösung charakterisiert. Unter Verwendung fluoreszenzmarkierter DNA-Sonden konnten wir herausfinden, dass die Penetration und Retention extrazellulärer DNA in Bakterienkolonien von der Länge des eindringenden Nukleotids und von der spezifischen Bindung der DNA an Bakterien durch die DNA-Aufnahmesequenz (DUS) abhängt. Wir stellen dabei insbesondere fest, dass die Penetrationsgeschwindigkeit als Funktion der DNA-Länge abnimmt. Jedoch erreicht auch genomische DNA anderer Spezies, in denen die DUS nicht vorkommt, innerhalb weniger Stunden das Zentrum der Kolonien. Genomische DNA von Gonokokken, in der die DUS in großer Zahl vorhanden ist, bindet hingegen effizient an die Peripherie der Kolonie, dringt jedoch nicht in deren Zentrum ein. Wir wenden unser Verständnis der Penetrationsdynamik zudem auf die Aufnahme und Transformation von DNA an. Zu diesem Zweck haben wir experimentelle Assays entwickelt, die den Nachweis beider Prozesse in Gegenwart externer DNA ermöglichen. Wir zeigen, dass die Transformationseffizienzen von der Länge der transformierenden DNA sowie von der Position der transformierenden Zellen innerhalb des Zellaggregates abhängen. Insbesondere stellen wir fest, dass sowohl die Aufnahme als auch die Transformation auf die äußere Peripherie von Kolonien beschränkt ist, was darauf hindeutet, dass Zellen im Koloniezentrum eine eingeschränkte oder begrenzte Kompetenz aufweisen. Schließlich untersuchen wir die Rolle der DNA als strukturelles Element der Biofilmmatrix, indem wir freie DNA mit einem zellundurchlässigen DNA-Farbstoff visualisieren. Dabei stellten wir fest, dass DNA ein Netzwerk von Filamenten in Zellaggregaten von Gonokokken bildet. Das Auflösen dieses Netzwerks beeinflusst die Koloniearchitektur und -morphologie, was darauf hindeutet, dass DNA tatsächlich ein wichtiger Bestandteil in Bakterienkolonien darstellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass extrazelluläre DNA selbst in jungen Kolonien in großen Mengen vorhanden ist, sowie, dass Gonokokken in kürzester Zeit ein Netzwerk aus DNA bilden, das große Teile der Kolonien umfasst. Darüber hinaus dringt externe DNA leicht in die Bakterienaggregate ein. Die Transformation von DNA bleibt jedoch auf die äußere Peripherie von Kolonien beschränkt, was Zweifel an der Vorstellung von Biofilmen als „Hot Spots“ für Gentransfer aufkommen lässt. Im Hinblick darauf, wird es von besonderer Bedeutung sein herauszufinden, durch welchen Mechanismus die Kompetenz zur Transformation innerhalb von Kolonien und bakteriellen Biofilmen gehemmt wird. UNSPECIFIED
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bender, Niklas niklum1989@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-549641
Date:	31 January 2022
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Physics > Institut für Biologische Physik
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language DNS; Bakterien; Biofilme; Transformation; DNS Aufnahme German DNA; Bacteria; Biofilms; Transformation; DNA uptake English
Date of oral exam:	20 January 2022
Referee:	Name Academic Title Maier, Berenike Prof. Dr. Bollenbach, Tobias Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/54964