Universität zu Köln

Sallach, Jessica (2014). Exploiting high-throughput screens to optimize Adeno-Associated Viral Vectors for gene transfer into primary human keratinocytes. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF Dissertation_JS.pdf Download (57MB)

Abstract

Chronic non-healing wounds such as diabetic ulcers or burns represent a devastating health problem with significant clinical, physical and social implications. The healing can be frustrating and painful for patients. The difficult healing process requires advanced therapeutic strategies such as the use of primary human keratinocytes (HK) as autologous transplants, which may be considered for clinical use. To improve engraftment or to introduce therapeutic genes into primary HK, efficient and safe vectors are required. One of the most promising vector systems today is based on the adeno-associated virus (AAV), a member of the parvovirus family. Recombinant AAV (rAAV) vectors possess a number of attractive properties including low immunogenicity, high stability and the potential to integrate site-specifically without known side-effects. Unfortunately, cell entry into primary HK of rAAV2 is barely detectable and consequentially, HK are poor targets of rAAV2-mediated transductions. As demonstrated in this thesis, primary HK do not express AAV2´s primary receptor heparan sulphate proteoglycan (HSPG), the presence of which, however, is required for binding to AAV2´s internalization receptors. Cell surface targeting allows re-directing the viral vector tropism towards a novel receptor mediating thereby transduction of cells in absence of AAV’s natural receptors. These AAV capsid mutants have displayed improved transduction efficiency in wild-type-AAV non-permissive cells and have provided the opportunity of rAAV-mediated, cell-type-specific gene transfer. As documented in this study, new rAAV vectors were developed as promising tools for modifying primary HK. Using an AAV peptide display library that displayed 7mer peptides of random sequence at capsid position 587; three AAV peptide insertion mutants differing in sequence of inserted ligand (Kera1, Kera2 and Kera3) were selected and subsequently analyzed. To select rAAV targeting vectors with a re-directed tropism, the library was optimized by depleting mutants capable of binding to HSPG prior to selection by heparin affinity chromatography. Furthermore, the selection was performed on primary HK obtained from different donors to target a common receptor and the selection pressure was continuously increased by decreasing the vector genomes per cell ratio to select for the fittest variant. The thereby developed rAAV targeting vectors Kera1 (RGDTATL), Kera2 (PRGDLAP) and Kera3 (RGDQQSL) showed a remarkable change in tropism, transducing primary HK with high efficiency and specificity even in mixed cultures of target and non-target cells. In this study, a novel microarray based bioinformatic approach (comparative gene analysis (CGA)), was used for the identification of the receptor that targeted the mutant that showed the most striking change in tropism, Kera2. Briefly, in cooperation with Giovanni Di Pasquale (NCI/NIH, Bethesda, USA), a screening of the NIH cell line panel was performed, pointing towards the involvement of beta8 integrin subunit for cell transduction by Kera2. Beta8 is unique as it is solely described as heterodimer with alpha V and the integrin αVβ8 could be detected on cell surface of primary human keratinocytes. By blocking experiments with blocking αV- or αVβ8-antibodies experimental evidence was provided that the integrin αVβ8 serves as receptor for Kera2. Finally, this study has shown that the targeting vectors Kera1, Kera2 and Kera3 transduced airlifted differentiated keratinocytes in organotypic 3D cultures. In summary, the three rAAV targeting vectors Kera1, Kera2 and Kera3, selected from an optimized library and using a novel selection strategy, are excellent candidates for successful application in clinical use.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Heilung chronischer Wunden, wie z.B. diabetischer Ulzera oder großflächiger Verbrennungswunden, stellt ein nicht unerhebliches medizinisches Problem dar. Der Heilungsprozess kann sehr langwierig und schmerzvoll sein und schränkt dadurch die Lebensqualität der Patienten massiv ein. Mit den traditionellen Vorgehensweisen und Maßnahmen zur Behandlung akuter Erkrankungen allein kann auf Grund der Vielzahl negativer Einflussmöglichkeiten kein optimales Ergebnis erzielt werden. Daher ist die Einführung neuer, innovativer, therapeutischer Strategien von Nöten, wie zum Beispiel die Verwendung von primären humanen Keratinozyten für die Herstellung autologer Hauttransplantate. Gentherapeutische Vektorsysteme könnten das Anwachsen von Hauttransplantaten durch z.B. gezielte, aber transiente Bereitstellung von Wachstumsfaktoren mittels Gentransfer verbessern. Rekombinante adeno-assoziierte Virus Vektoren (rAAV) wären hierfür ein potentiell geeignetes System. Sie sind wenig immunogen und stabil, lassen sich mit hohen Titern herstellen und sind als nicht-integrierende Vektoren in proliferierenden Zellen nur transient vorhanden. Allerdings scheint die Haut ein schlechtes Zielorgan für AAV Vektoren des Serotypes 2, sowie pseudotypisierte AAV Vektoren mit Kapsiden anderer AAV Serotypen zu sein, da sich primäre humane Keratinozyten nur unzureichend von AAV transduzieren lassen. Ein Grund hierfür wurde im Rahmen dieser Arbeit gefunden. Es konnte gezeigt werden, dass primäre humane Keratinozyten den AAV2-Primärrezeptor Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG) nur unzureichend oder gar nicht exprimieren. Kürzlich wurde demonstriert, dass die genetische Modifizierung des AAV-Kapsids durch Insertion rezeptorspezifischer Liganden („AAV targeting“) die Transduktion von Zellen unabhängig vom Vorhandensein der natürlichen AAV-Rezeptoren ermöglicht. Die „AAV-targeting“-Technologie bietet einen möglichen Lösungsansatz um spezifische rAAV2-Targeting-Vektoren für primäre humane Keratinozyten zu generieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue, vielversprechende rAAV Vektoren für die Modifikation primärer humaner Keratinozyten generiert. Mit Hilfe einer „AAV peptide display“ Bibliothek wurden drei rAAV Peptidinsertionsmutanten (Kera1, Kera2 und Kera3), die sich in der inserierten Sequenz unterscheiden, selektioniert. Die AAV2-Bibliothek besteht aus Mutanten, die 7-mer Peptide mit zufälliger Sequenz im Kapsid in der Position 587 präsentieren. Um „targeting“-Vektoren mit einem veränderten Tropismus zu generieren, wurde die AAV-Bibliothek optimiert, indem Mutanten die an HSPG binden können vor der Selektion durch Heparinaffinitätschromatographie abgereichert wurden. Eine weitere Optimierung des Selektionsschemas wurde durch die Verwendung von verschiedenen Keratinozyten-Spendern in jeder Selektionsrunde erzielt. Das erhöhte die Wahrscheinlichkeit Mutanten mit Spezifität für einen allgemeingültigen Rezeptor für primäre humane Keratinozyten zu selektionieren. Die auf diese Weise selektionierten Mutanten Kera1 (RGDTATL), Kera2 (PRGDLAP) und Kera3 (RGDQQSL) weisen eine außergewöhnliche Änderung des Tropismus auf. Sie transduzieren primäre humane Keratinozyten mit einer hohen Effizienz und Spezifität, was selbst in Mischkultur-Experimenten mit Nicht-Ziel-Zellen zu einer präferentiellen Transduktion von Keratinozyten führte. In dieser Arbeit wurde zudem erstmalig die neue bioinformatische Methode der komparativen Genanalyse (CGA) zur Identifizierung des Ziel-Rezeptors eines rAAV-targeting Vektors angewandt. In Kooperation mit Giovanni Di Pasquale (NCI/NIH, Bethesda, USA) wurde zu diesem Zweck ein Zellscreening auf der NIH Zellliniensammlung durchgeführt. Für die Mutante Kera2 konnte mit Hilfe dieses Verfahren eine hohe Affinität zu dem Integrin-Rezeptor beta8 festgestellt werden. Die Integrin beta8 Untereinheit bildet mit der Integrin alpha V Untereinheit ein Heterodimer. Das Intergin αVβ8 wird tatsächlich auf der Oberfläche von primären Keratinozyten expressioniert. Durch Experimente mit blockierenden αV- oder αVβ8-Antikörpern konnte nachgewiesen werden, dass das Integrin αVβ8 als Rezeptor für Kera2 fungiert. Außerdem war es möglich differenzierte Keratinozyten einer 3D Kultur nach topischer Anwendung der „targeting“-Vektoren Kera1, Kera2 und Kera3 zu transduzieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die drei in dieser Arbeit entwickelten und charakterisierten „targeting“-Vektoren Kera1, Kera2 und Kera3 Schlüsselfunktionen für die klinische Anwendung erfüllen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Sallach, Jessica jessica.sallach@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-55615
Date:	2014
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Zentrum für Molekulare Medizin
Subjects:	Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language adeno-associated virus (AAV, primary human keratinocytes, recombinant AAV (rAAV) vectors, integrin αVβ8, organotypic 3D cultures, gene therapy, UNSPECIFIED
Date of oral exam:	9 September 2013
Referee:	Name Academic Title Knebel-Mörsdorf, Dagmar Prof. Dr Brachvogel, Bent PD Dr
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5561