Universität zu Köln

Lehmann, Martin (2014). A Novel Model System to Study the Role of Catecholamines in Cardiac Lineage Commitment of Embryonic Stem Cells and Functional Response to Proarrhythmic Drugs. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of the blastocyst. These cells possess the ability to differentiate into all cell types of the three germ-layers and to proliferate indefinitely. In defined conditions ES cells are committed to the mesodermal lineage and differentiate, amongst other cell types, into cardiomyocytes (CMs). The processes underlying mesodermal and subsequent cardiac differentiation are yet only partially understood. Catecholamine release is well known to modulate heart rate and force in adult mammals. Despite first evidence, only little is known about an involvement of catecholamines during embryonic heart development. Therefore the work aimed to investigate in more detail whether catecholamines are involved in the process of ES cell cardiac differentiation in vitro. Effects of catecholamine depletion induced by reserpine were investigated during murine D3 PIG44 ES cell differentiation. Reserpine is a drug blocking vesicular storage of monoamines, and as a result depletes cells of the catecholamines norepinephrine and epinephrine. Cardiac differentiation was assessed by quantification of beating clusters, immunocytochemistry, molecular biology, flowcytometry and pharmacological approaches. Proliferation and cytotoxicity was evaluated by embryoid body cross-section measurements and impedance monitoring, while functional characterization of CMs was performed using extracellular field potential (FP) recordings with microelectrode arrays (MEAs). Involvement of -adrenoceptor signaling was studied differentiating ES cells in the presence of reserpine and isoproterenol. To further discriminate between drug-specific effects of reserpine and catecholamine action via adrenergic receptors we applied the unspecific α- and β-receptor antagonists phentolamine and propranolol during differentiation. Reserpine treatment led to a remarkable reduction of beating cardiac clusters, down-regulation of cardiac proteins actinin and troponinT and delayed mesodermal and cardiac gene expression. In more detail, the average ratio of ~40% spontaneously beating control clusters was significantly reduced by 100%, 91.1% and 20.0% on days 10, 12, and 14, respectively. In line, significant reduction by 71.6% (n=11) of eGFP expressing CMs after reserpine treatment was revealed by flowcytometry. Reserpine neither reduced EB size nor acted cytotoxic on CMs, while an increased numbers of neuronal cells were observed. MEA measurements with reserpine-treated EBs showed lower FP frequencies and weak responsiveness to adrenergic and muscarinic stimulation. Co-application of isoproterenol and reserpine during differentiation partially rescued cardiac development. The developmental inhibition after α- and β-adrenergic blocker application mimicked developmental changes with reserpine and proved an involvement of adrenergic receptors in the process. We conclude that catecholamines and adrenergic signaling play a critical role during cardiac development in ES cells. Since we experienced the ES cell/MEA model as useful for pharmacological approaches, we wondered as a next step whether pluripotent ES cell-derived CMs could be used for safety pharmacological drug screening with cardio-active compounds. Concentration/response was tested in rhesus monkey and human ES cell- and human induced pluripotent stem cell-derived CMs (rESCMs, hESCMs and, hiPSCMs, respectively) for different drugs at increasing concentrations. Empirical observation under physiologic positive and negative chronotropic drug-stimulation showed negative correlations of FP duration (FPDur) and beating frequency (negative FP/f correlation). Negative FP/f correlation persisted independent of cell lines in hESCMs and hiPSCMs. In contrast, FP/f correlations changed to positive values in the presence of E4031 and sotalol in a concentration-dependent manner. Therefore, it was concluded that safety pharmacological drug-screening is feasible using ES cell-derived CMs and MEAs independent of cell lines and species origin. Furthermore a novel method to qualitatively evaluate QT-time/repolarization prolonging drug effects based on FP/f correlations is sugested. The results may help to reduce cost-intensive clinical trials and, above all, to reduce the number of animal experiments.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Embryonale Stammzellen werden aus der inneren Zellmasse von Blastozysten gewonnen. Diese Zellen besitzen die Eigenschaft in alle Zelltypen der drei Keimblätter zu differenzieren und unendlich zu proliferieren. Unter den geeigneten Bedingungen lassen sich aus embryonalen Stammzellen mesodermale Zellen generieren, die neben anderen Zellen, zu Kardiomyozyten differenzieren. Die Prozesse, die mesodermaler und anschließender kardialer Differenzierung zugrunde liegen sind jedoch erst teilweise erforscht. Man weiß, dass über Katecholamineausschüttung die Herzfrequenz und die Kontraktionskraft des Herzens in adulten Säugetieren reguliert wird. Obwohl vorläufige Ergebnisse darauf hindeuten, weiß man allerdings erst sehr wenig ob Katecholamine während der embryonalen Herzentwicklung eine Rolle spielen. Daher soll in dieser Arbeit detailliert untersucht werden, ob Katecholamine in vitro am Prozess der kardialen Differenzierung von Stammzellen beteiligt sind. Die Effekte, die durch Reserpin-induzierte Katecholamin-Verarmung hervorgerufen wurden, sollten während der Differenzierung muriner embryonaler D3 PIG44 Stammzellen untersucht werden. Reserpin blockiert den vesikulären Transport von Katecholaminen, und als Folge verarmen die Zellen an Noradrenalin und Adrenalin. Die Auswirkungen auf die kardiale Differenzierung wurden durch die Quantifizierung kontrahierender Cluster, immunhistochemischer und molekularbiologischer Methoden, sowie Durchflusszytometrie und pharmakologischer Methoden ermittelt. Die Prolifertation und Zytotoxizitätseffekte wurden jeweils mit Hilfe von Querschnittsflächen-Messungen von Embryonalkörpern (EBs) beziehungsweise Impedanz Messungen untersucht, wohingegen man extrazelluläre Feldpotential (FP) Messungen durch Microelektroden Arrays (MEA) dazu benutzte, die Funktionalität der Kardiomyozyten zu prüfen. -Adrenozeptor vermittelte Signale als Ursache der beobachteten Prozesse, wurde durch Differenzierung der Stammzellen unter gleichzeitiger Zugabe von Reserpin und Isoproterenol (ISO) untersucht. Um darüber hinaus zwischen Reserpin-spezifischen Effekten und Katecholamin-vermittelter - und -Adrenozeptor Wirkung zu unterscheiden, wurden die Stammzellen während der Differenzierung den entsprechenden Antagonisten, Phentolamin und Propranolol, ausgesetzt. Reserpin führte zu einer deutlichen Reduktion schlagender kardialer Cluster und zu herab-regulierter Expression der kardialen Proteine α-Actinin und TroponinT sowie mesodermaler und kardialer Gene. Im Detail beobachtete man, dass die in Kontrol EBs bei ungefähr 40% liegende Rate schlagender Areale an den Tagen 10, 12 und 14 signifikant um entsprechend 100%, 91,1% und 20% reduziert waren. Genauso zeigten Durchflusszytometrie Experimente eine Reduzierung eGFP-exprimierender Kardiomyozyten um 71,6%. Reserpin hatte weder einen Einfluss auf die EB Größe noch auf Zytotoxizität, jedoch wurde interessanterweise eine erhöhte Anzahl von Neuronen beobachtet. Die MEA Versuche ergaben verringerte Schlagraten in Reserpin-behandelten EBs und sehr geringe Empfindlichkeit gegenüber adrenerger und muskarinerger Stimulation. Eine co-Applikation von Reserpin mit ISO bewirkte einen partiellen „Rescue“ der kardialen Entwicklung. Außerdem beobachtete man, dass die kardiale Entwicklungsverzögerung nach - und -Blocker Behandlung in hohem Maß der Verzögerung nach der Reserpin Behandlung glich. Dadurch konnte der Einfluss der adrenergen Rezeptoren gezeigt werden. Es lässt sich daher aus dieser Arbeit schlussfolgern, dass Katecholamine eine kritische Rolle bei der Herzentwicklung spielen und dass adrenerge Rezeptoren daran beteiligt sind. Da sich das ES Zell/MEA Modell als sehr geeignet für pharmakologische Untersuchungen erwiesen hat, stellte sich die Frage ob man pluripotente Stammzellen für sicherheitspharmakologische Screenings kardioaktiver Substanzen nutzen kann. Die Kombination von Stammzellen als unbegrenzte Quelle für Kardiomyozyten zu dienen mit dem Vorteil der MEA-Technik über lange Zeiträume extrazellulär ableiten zu können, stellt eine ideale Methode für Drogen-Screens dar. Die konzentrationsabhängige Antwort verschiedener Drogen wurde daher an verschiedene Rhesusaffen und humanen embryonalen und induziert-pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten (entsprechend rESCMs, hESCMs und hiPSCMs) getestet. Unter physiologisch positiven und negativen chronotropen Bedingungen beobachtete man eine negative Korrelation zwischen der FP Dauer (FPDur) und der Schlagfrequenz (negative FP/f Korrelation). Negative FP/f Korrelation wurden unabhängig voneinander bei ESCMs und iPSCMs beobachtet. Im Gegensatz dazu änderte die Zugabe von E4031 und Sotalol die FP/f Korrelation zu positiven Werten. Anhand der empirischen Daten kann man zeigen, dass ein sicherheitspharmakologischer Screen, basierend auf pluripotenten Stammzellen und dem MEA System, unabhängig von Zelllinie und Spezies durchgeführt werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit schlagen wir eine neue graphische Methode der qualitativen Evaluierung substanz-abhängiger QT-Zeit- bzw. Repolarisations-Effekte vor. Die Ergebnisse daraus können in Zukunft dazu beitragen, Kosten bei der Medikamentenforschung einzusparen und, vor Allem, die Zahl an Versuchstieren deutlich zu verringern. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Lehmann, Martin martin.lehmann56@yahoo.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-56501
Date:	2 July 2014
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Physiologie und Pathophysiologie > Institut für Neurophysiologie
Subjects:	Generalities, Science Natural sciences and mathematics Life sciences Technology (Applied sciences) Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language embryonic stem cells English multielectrode arrays English MEA English drug screen English drug screening English Rhesus monkey English catecholamines English induced pluripotent stem cells English cardiomyocytes English cardiac English differentiation English impedance measurements English mouse English microelectrode arrays English reserpin UNSPECIFIED
Date of oral exam:	11 February 2014
Referee:	Name Academic Title Paulsson, Mats Prof. Dr. Plickert, Günter Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5650