Universität zu Köln

Martens, Martin (2015). Functional analysis of ATM and ATR in the moss Physcomitrella patens. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF PhD_Thesis_Martin_Martens_2015.pdf - Accepted Version Download (5MB)

Abstract

Homologous recombination (HR) is an essential biological process, which plays a pivotal role in mechanisms such as meiotic crossover and the reparation of DNA double strand breaks. In addition to being a fundamental process of life, it is also the basis of gene targeting, a technical application, which utilizes the cells HR apparatus for precise genome editing. While GT has been successfully employed for functional genome analysis in mice and yeast, higher plants are innately inefficient in GT. This is because they repair DNA double strand breaks preferentially with another pathway, non homologous end joining (NHEJ), which does not lead to targeted insertions. On the other hand, the moss Physcomitrella patens preferentially uses HR for DSB repair as well as transgene integration. This feature makes P. patens a suitable model organism for studying HR in general, which could also provide a better understanding of its outstanding GT properties. In order to extend our knowledge on this subject, the present thesis focused on two major topics. In the first part the inventory of DNA repair and recombination genes in P. patens was assessed via a BLAST based approach, which was made possible by the recent release of the P. patens genome draft. Intriguingly, P. patens possesses all important NHEJ genes, therefore its bias for HR over NHEJ could not be explained based on simple presence or absence of known NHEJ genes. On the other hand, there were similarities regarding the absence/presence of HR genes between P. patens and the also highly HR biased and GT efficient yeast. For example, BRCA1, BRCA2 and BARD1 are neither found in P. patens nor in yeast. Even more intriguingly they are available in Arabidopsis and also humans, where NHEJ is the dominant pathway. A further remarkable observation was that for 33 of the DNA repair and recombination related genes available in P. patens additional paralogs were identified. These paralogs are certainly interesting candidates for further studies. The second part of the thesis focused on the ATM (ataxia telangiectasia mutated) and ATR (ATM and Rad3-related) kinases, two key upstream signaling components of HR mediated DNA DSB repair. Utilizing the proficiency of P. patens in gene targeting ATM and ATR single as well as double mutants were generated by disrupting their kinase domains. These mutants were then used to characterize the function of the P. patens ATM and ATR homologs. Observing the mutant lines it was found that the loss of ATR function severely compromised vegetative and reproductive development while ATM disruption had just a mild effect on vegetative development. Testing the sensitivity of the mutant lines to various DNA DSB inducing agents it was found that in P. patens mainly ATR is required to facilitate the repair of these lesions, a situation similar to yeast but different to human cells and Arabidopsis, where also loss of ATM markedly affects sensitivity to these genotoxic agents. Similarly, another response to DNA DSB, the arrest of the cell cycle is also mediated by largely ATR in P. patens as well as yeast, while in Arabidopsis and human cells ATM also plays an important role. As part of the mutant phenotype analysis, the effect of ATM and ATR loss of function on the mode of transgene integration was tested. It was found that removal of ATM function significantly increased NHEJ mediated random integrations while targeted integrations were unaffected, the latter were reduced only in the ATM and ATR double mutant. Another major part of the thesis was to assess the global transcriptional change in response to bleomycin mediated DNA DSB induction in wild type as well as in mutant lines. Although P. patens is known to be biased towards HR, unexpectedly, in addition to HR genes also NHEJ genes were found transcriptionally induced in the wild type. Comparing the transcriptomes of wild type and mutant lines large differences in transcript levels were already observed without bleomycin treatment. Additional bleomycin treatment showed that a large number of DNA damage responsive transcripts could not be induced or repressed in the mutant lines. Another interesting finding was that while the transcriptional DNA damage response in Arabidopsis appears to largely rely on ATM function, in P. patens ATR seem to be more important in this regard.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Funktionelle Analyse von ATM und ATR im Moos Physcomitrella patens German
Translated abstract:	Abstract Language Als Homologe Rekombination (HR) wird ein essentieller biologischer Vorgang bezeichnet, der im Zuge des meiotischen Crossovers sowie in der Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen Anwendung findet. Darüber hinaus ist dieser Vorgang auch die Basis von Gentargeting (GT), eine technische Anwendung, welche den zellulären Rekombinationsapparat nutzt, um gezielt genomische Mutationen zu erzeugen. GT wird mit großem Erfolg in der funktionellen Genomanalyse in Hefe und Maus eingesetzt. In höheren Pflanzen jedoch ist diese Methode generell ineffizient, was dadurch erklärt wird, dass in Diesen DNA Doppelstrangbrüche (DSB) hauptsächlich mittels eines anderen Mechanismus repariert werden, der nicht-homologen Rekombination. Das Moos Physcomitrella patens hingegen nutzt vorzugsweise HR, sowohl für die Reparatur von DNA DSB als auch zur Integration von Transgenen. Diese Eigenschaft macht P. patens zu einem geeigneten Modellorganismus um grundlegende Aspekte der HR zu studieren und um das Verständnis seiner außergewöhnlichen GT Eigenschaften zu vertiefen. Um die Wissensgrundlage auf diesem Gebiet zu erweitern, wurden in der vorliegenden Arbeit zwei Themengebiete bearbeitet. Im ersten Teil wurde der Bestand an DNA-Reparatur und –Rekombinationsgenen mittels eines BLAST basierten Ansatzes ermittelt, ein Unterfangen welches durch die kürzlich geschehene Veröffentlichung der Genomsequenz von P.patens ermöglicht wurde. Wie sich herausstellte besitzt P. patens alle bekannten wichtigen Gene der nicht-homologen Rekombination wodurch dessen Präferenz für HR nicht durch die An- oder Abwesenheit von NHEJ Genen zu erklären ist. Andererseits wurden Ähnlichkeiten bezüglich des HR Gen Bestandes zwischen P. patens und Hefe festgestellt, einem Organismus welcher ebenfalls bevorzugt HR nutzt und eine hohe GT Effizienz aufweist. Während zum Beispiel BRCA1, BRCA2 und BARD1 weder in P. patens noch in Hefe gefunden wurden, sind sie sowohl in Arabidopsis als auch im Mensch vorhanden, zwei Organismen in denen NHEJ dominiert. Eine weitere bemerkenswerte Feststellung war, dass für 33 der in P. patens detektierten DNA Reparatur- und Rekombinationsgene zusätzliche Paraloge gefunden wurden. Dies sind interessante Kandidaten für weitere Studien. Der zweite Teil der Arbeit fokussierte sich auf ATM (ataxia telangiectasia mutated) und ATR (ATM and Rad3-related), zwei Kinasen die eine Schlüsselfunktion in der Signalkaskade zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen via HR innehaben. Unter Nutzung der hohen GT Effizienz in P. patens wurden ATM und ATR Einzel- und Doppelmutanten erzeugt, indem ein Teil der Kinasedomäne durch eine Selektionskassette ersetzt wurde. Diese Mutanten wurden zur Untersuchung der Funktion der ATM und ATR Homologe von P. patens eingesetzt. In Bezug auf Wachstum und Entwicklung wurde beobachtet, dass der Verlust der Funktion von ATR zu schwerwiegenden Defekten in späteren Entwicklungsstadien sowie Sterilität führte, während ein Verlust der ATM Funktion lediglich geringfügige morphologische Veränderungen hervorrief. Um zu testen inwiefern P. patens ATM und ATR ebenfalls eine Rolle in der Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen spielen wurden die Mutanten auf ihre Sensitivität gegenüber verschiedenen DNA DSB induzierenden Substanzen getestet. Es wurde festgestellt, dass in P. patens hauptsächlich ATR und nicht ATM für die Reparatur von DNA DSB benötigt wird, ähnlich wie in Hefe, aber im Unterschied zu Arabidopsis und menschlichen Zellen, wo ATM und ATR von ähnlicher Relevanz sind. Weitere Untersuchungen ergaben dass ein zentraler Schritt in der Reparatur von DNA DSB, der Arrest des Zellzyklus, in P. patens ebenfalls hauptsächlich durch ATR vermittelt wird. Dies stellt abermals eine Paralelle zu Hefe dar während in Arabidopsis und menschlichen Zellen ATM abermals eine mindestens ebenso wichtige Rolle spielt. Ein weiterer Aspekt der Phänotyp Analyse war es zu ermitteln ob der Verlust von ATM oder ATR einen Effekt auf Gentargeting haben würde. Es stellte sich heraus dass der Verlust der ATM Funktion zu einem signifikanten Anstieg zufälliger, durch nicht-homologe Rekombination vermittelte, Integrationen führte. Überdies wurde auch ein deutlicher Rückgang gezielter Integrationen beobachtet, allerdings nur in der ATM/ATR Doppelmutante. Im Zuge der Analyse des globalen Transkriptionsmusters in Antwort auf Bleomycin induzierte DNA DSB im Wildtyp als auch in den Mutanten wurden einige interessante Beobachtungen gemacht. Zum einen wurde festgestellt dass, obwohl P. patens dafür bekannt ist eine Prädisposition bezüglich HR aufzuweisen, die Behandlung mit Bleomycin ebenfalls Gene die der nicht-homologen Rekombination zugeordnet sind induzierte. Beim Vergleich der Transkriptlevel von Wildtyp und Mutanten, zunächst im ungestressten Zustand, wurde festgestellt dass eine Vielzahl von Transkripten eine bereits erhöhte/erniedrigte Expression aufwies. Darüber hinaus zeigte in den Mutanten eine Vielzahl von Transkripten der DNA Schadensantwort keinerlei Responz auf die Bleomycin Behandlung. Letztlich ist noch zu vermerken, dass während die transkriptionelle Antwort auf DNA Schäden in Arabidopsis hauptsächlich unter Kontrolle von ATM zu sein scheint, in P. patens ATR die wichtigere Rolle spielt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Martens, Martin mmartens1979@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-61512
Date:	May 2015
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language ATM; ATR; DNA repair; DNA damage; gene targeting; recombination; Physcomitrella patens; SuperSAGE; English
Date of oral exam:	15 January 2015
Referee:	Name Academic Title Koornneef, Maarten Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6151