Isolation and Characterisation of Novel AtPIN Genes from Arabidopsis thaliana L.

Friml, Jiri (2000). Isolation and Characterisation of Novel AtPIN Genes from Arabidopsis thaliana L. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Das Phytohormon Auxin ist für die Morphogenese, das axiale und tropische Wachstum, die Leitgewebedifferenzierung ebenso wie für viele andere pflanzliche Prozesse von Bedeutung. Der Transport dieses Phytohormons spielt eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der physiologischen Wirkungen dieses Hormons. Auf auxintransportdefizienten Mutanten aus Arabidopsis thaliana aufbauend, gelang kürzlich in unserer Arbeitsgruppe die Isolierung der ersten zellpolar positionierten Auxineffluxcarrierproteine (AtPIN1, AtPIN2). Wegen des breiten Spektrums zellulärer und gewebespezifischer Auxinflüsse liegt die Vermutung nahe, daß eine Familie von Proteinen in Arabidopsis thaliana vorliegt. Die Isolierung neuer Mitglieder und Aufdeckung der Genvielfalt dieser Familie war das zentrale Thema der vorliegenden Arbeit. Mit Gensonden, die von schon bekannten Mitgliedern der PIN Genfamilie abgeleitet wurden, wurde geprüft, wieviele Mitglieder dieser Familie wahrscheinlich in A. thaliana vorliegen. Die Überprüfung einer geordnet vorliegenden genomischen BAC Bank legte eine Zahl von wenigstens 12 Mitgliedern nahe. Weitere potentielle Kandidaten wurden identifiziert, aber nicht weiter charakterisiert. 5 Kandidaten (AtPIN3 bis AtPIN7) wurden für weitergehende Untersuchungen ausgewählt. Die Charakterisierung beinhaltete (1) die Isolierung vollständiger cDNAs, (2) die Kartierung der genomischen loci, (3) die rekombinante Expression von Fragmenten und Herstellung von Antikörpern, (4) die gewebe- und zellspezifische Analyse der Expression ausgewählter AtPIN Gene (mRNA und Protein), und (5) die Isolierung und nachfolgende genetische und zellbiologische Charakterisierung von Insertionsmutanten. 2 dieser Gene (AtPIN3 und AtPIN4) wurden für eine detailierte Analyse ausgewählt. Die Kartierung der Gene AtPIN3-AtPIN7 unter Verwendung einer BAC Bibliothek ergab, daß AtPIN3, AtPIN6 und AtPIN7 wahrscheinlich in einem Gencluster auf Chromosom 1 liegen. AtPIN4 wurde auf Chromosom 2 und AtPIN5 auf Chromosom 5 lokalisiert. Für alle Gene konnten Insertionsmutanten identifiziert werden. Diese wurden genetisch charakterisiert (Reversion, Footprintmutanten, homozygote Linien). Insertionsmutanten der Gene AtPIN3 und AtPIN4 wurden für die in dieser Arbeit beschriebenen funktionellen Untersuchungen herangezogen. In silico Analysen ergaben, daß alle aus den Gensequenzen vorhergesagten Proteine eine zu AtPIN1 grundsätzlich ähnliche Topologie aufweisen. In den N- und C-terminalen Bereichen werden jeweils 2 aus wahrscheinlich 5-6 Transmembransegementen bestehende hydrophobe Bereiche vorhergesagt. Diese sind durch eine hydrophile Schleife miteinander verbunden. AtPIN5 scheint keine oder nur eine sehr kurze Schleifenregion zu haben. Die hydrophile Schleifenregion wurde für heterologe Expressionstudien ausgewählt. Bereiche mit hoher Antigenizität und Sequenzdiversität wurden als translationale Fusionsproteine mit 6 N-terminalen Histidinen in E. coli hergestellt, aufgereinigt und zur Herstellung polyklonaler Antikörper in Kaninchen eingesetzt. Diese Antikörper wurden anschliessend affinitätsgereinigt und für zellbiologische Untersuchungen eingesetzt. Indieser Arbeit wurde die Herstellung und Nutzung der Antikörper für AtPIN3 und AtPIN4 beschrieben. Die Expression der Gene AtPIN3 und AtPIN4 wurde detailiert untersucht. Diese Untersuchung ergab, daß das AtPIN3 Gen in verschiedenen Geweben und Zelltypen exprimiert vorliegt. Eine spezifische Expression von AtPIN3 wurde in Endodermiszellen im Hypokotyl und der Blütenstandsachse nachgewiesen. Eine detailierte Untersuchung durch whole mount in situ Hybridisierung zeigte ein erhöhtes Expressionsniveau in der Wurzelhaube. Diese Expression konnte durch Immunlokalisation für das AtPIN3 Protein bestätigt werden. Das AtPIN3 Protein lag in den Zellen der Wurzelhaube nicht polar verteilt vor. Eine vorzugsweise laterale Verteilung des AtPIN3 Proteins wurde in den Endodermiszellen des Hypokotyls und des Stengels beobachtet. Die Analyse der Mutanten zeigte, daß in diesen Mutanten das AtPIN3 Leseraster zerstört worden war. Somit konnte immuncytochemisch keine AtPIN3 Expression mehr nachgewiesen werden. Die Zerstörung des AtPIN4 Gens resultierte in einer Veränderung der Musterbildung. Diese Mutanten zeigten in Weisslicht eine charakteristische Reduzierung des Hypokotyl- und Stengelwachstums. Die Öffnung des Hypokotylhakens war gegenüber Wildtyp Arabidopsispflanzen deutlich verzögert. Diese Pflanzen zeigten außerdem ein gestörtes phototropes und ein gestörtes gravitropes Wachstum. Zusammengenommen deuten alle bislang verfügbaren Daten auf eine Funktion des AtPIN3 Proteins in der lateralen Auxinverteilung hin. Die Expression des AtPIN4 Gens wurde durch whole mount in situ Hybridisierung in Wurzelspitzen nachgewiesen. Die immunzytochemische Analyse des AtPIN4 Proteins bestätigte dieses Expressionsmuster. In Embryonen konnte die Expression schon im globulären Stadium gezeigt werden. Im Verlauf der Embryonalentwicklung wurde eine dynamische Veränderung der Expression festgestellt. Besonders charakteristisch war die Expression in der Lenticularzelle und in den sich hieraus entwickelnden Nachfolgezellen des ruhenden Zentrums. Postembryonal wurde AtPIN4 im ruhenden Zentrum und in den diesen Bereich umgebenden Initialzellen nachgewiesen. Je nach Zelltyp wurde eine polare oder apolare Lokalisierung des AtPIN4 Proteins beobachtet. In Nullmutanten mit zerstörter AtPIN4 Funktion wurden auffällige Veränderungen im Expressionsmuster eines auxinsensitiven synthetischen Promotor nachgewiesen. Diese Ergebnisse lassen auf eine Veränderung des Auxingradienten im Wurzelbereich schliessen. Ausserdem wurden im Meristem auffällige Veränderung in der Ausprägung der Musterbildung fest gestellt. Weiterführende genetische und biochemische, zum Zeitpunkt der Abgabe dieser Arbeit aber noch nicht vollständig abgeschlossene Arbeiten, deuten auf eine wichtige Rolle des AtPIN4 Proteins in der Auxinumverteilung hin, die in der Arabidopsis Wurzelspitze erfolgt. In dieser Arbeit wurden zwei der fünf neu isolierten AtPIN Gene funktionell charakterisiert. Durch Einsatz eines breiten Spektrums genetischer und molekularer Techniken konnte zum erstenmal ein klarer Zusammenhang zwischen Auxintransport und Musterbildungsprozessen aufgezeigt werden.

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