Universität zu Köln

Borowski, Swantje Heidi (2015). Biochemische Untersuchungen an den eukaryotischen Initiationsfaktoren 4A/4G. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The translation initiation factors eIF4A and eIF4G form, together with the cap-binding protein eIF4E, the eIF4F complex, which is crucial for both recruiting the small ribosomal subunit 40 S to the 5’-untranslated regions of the mRNAs and for the subsequent scanning process. The eIF4A complex is an ATP-dependent RNA helicase whose activity is stimulated by binding to eIF4G. In mammals, this scaffold protein has two binding motifs for eIF4A, one of which is located on the eIF4G middle domain (eIF4GMD) and acts as an activator upon helicase activity. The other binding motif is found in the C-terminal domain (eIF4GCD) with a regulatory mode upon activity in order to co-ordinate the shuttling of eIF4A to the middle domain (eIF4GMD). So-called weak mRNAs, which possess long and highly structured 5 ́-untranslated regions present in many crucial regulatory messages, e.g. ODC or VEGF, are over-proportionally translated upon up-regulation of the eIF4F complex, which therefore represents a potential target for the development of anti-cancer chemotherapeutics. In this context, one aim of this thesis was the discovery of small drug-like molecules that inhibit complex formations between eIF4G and eIF4A. To this end, a high-throughput suitable HTR-FRET (Homogenous Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer, Cisbio Bioassays) assay was developed and applied to screen a library of 16544 compounds. As a result, 252 potential target compounds were identified after screen validation, 1 of which showed IC50 value lower than 10 µM. Further, the interface properties of the complex between eIF4A and eIF4G were investigated. In order to obtain a closer understanding of the inhibitory influence of eIF4GCD on eIF4A activity and of the atomic characteristics of the eIF4A:eIF4GCD interface, crystallisation of the eIF4GCD:eIF4A complex was examined in detail. Crystals were obtained by the counter diffusion method, but these crystals did not show any diffraction at the SLS (Swiss Light Source, Paul Scherrer Institute, Villigen Switzerland). Therefore, surface entropy reduction mutations were introduced to remove clusters of flexible amino acids of eIF4GCD. Though all of these cluster mutants show a similar binding affinity to eIF4A compared to the wild type, they failed to form any crystals in the present study. Since most of the flexible regions were located in the C-terminal part of eIF4ICD, a truncated construct was generated (eIF4GICD(1426)), which still binds to eIF4A. Biolayer interferometry (BLI) experiments were conducted, and the KD of eIF4GICD(1426):eIF4A was estimated to about 198nM. Sitting drop crystallisation experiments using this truncated protein in complex with eIF4A did yield crystals that, however, lacked suitable diffraction properties. The crystals were morphologically improved by seeding but the quality of the diffraction at the SLS was still insufficient for revealing the crystal structure. It is well known that eIF4A possesses a very flexible C-terminal domain; therefore surface entropy reduction attempts were employed here as well. Because eIF4A is very much conserved, finding suitable candidate mutants present in other members of the DEAD Box helicases family was difficult. All generated variants became insoluble when expressed in E. coli. To remove flexibility in eIF4A, an S-S-crosslink was designed to ensure a closed conformation of the two RecA-like domains of eIF4A. To this end, in eIF4A, the residues Gly-70 (walker A motif) and Arg-367 (arginine finger) were mutated to cysteines supposed to form a disulfide bridge under oxidative conditions and thus to lock the N- and C-terminal RecA domains in the closed conformation. The success of this approach could be confirmed via SDS Page analysis. Using BLI studies, it could be further demonstrated that the closed conformation of eIF4A had lost its binding to eIF4GCD, but that it could be restored to wild-type levels by adding the reducing agent DTT. This finding implies that by complex formation, eIF4GCD arrests eIF4A in the open conformation and that it therefore might well interact with both RecA-like domains: N-terminal and C-terminal. Indeed, gel filtration and BLI experiments confirmed the requirement for both eIF4A domains to bind to eIF4GCD. This result may be the molecular reason for the modulation of eIF4A activity and translation initiation. In future studies, candidate compounds identified in the FRET screen should be further validated, chemically developed for affinity, and crystallized with eIF4A or eIF4GCD, depending on to which component they bind more tightly.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language UNSPECIFIED English
Translated abstract:	Abstract Language Die Translationsinitiation untersteht einer engen Kontrolle, wofür die eukaryotischen Initiationsfaktoren (elF) verantwortlich sind. Ein sehr wichtiger Schritt bei der Translations-initiation ist die Bildung des eIF4F-Komplexes; dieser besteht aus der ATP-abhängigen RNA-Helikase eIF4A und dem Ankerprotein eIF4G sowie dem Cap bindenden Protein eIF4E. Dieser gesamte Komplex ist verantwortlich für die Rekrutierung der 40-S ribosomalen Untereinheit an den 5’-nicht-kodierenden Bereich der mRNAs und den daran anschließenden Scanningprozess. Die Aktivität von eIF4A wird durch die Bindung an eIF4G reguliert. In Säugetieren weist eIF4G zwei bindende Motive auf, wovon eins in der mittleren Domäne (eIF4GMD) lokalisiert ist und einen aktivierenden Effekt auf die Aktivität von eIF4A hat. Das andere findet sich in der C-terminalen Domäne (eIF4GICD), hat einen regulatorischen Effekt auf die Aktivität und dient der Übergabe von eIF4A an die mittlere Domäne eIF4GMD. Sogenannte schwache mRNAs verfügen über lange und stark strukturierte 5’-nicht-kodierende Bereiche, die bei vielen zentralen regulatorischen mRNAs, z.B. der Ornithindecarboxylase (OCD) oder dem Endothelwachstumsfaktor (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) vorkommen. Diese mRNAs sind unter gewissen Bedingungen hochreguliert und bewirken damit ebenso eine Hochregulierung des eIF4F-Komplexes. Aus diesem Grund ist der eIF4F-Komplex ein potenziell interessantes Ziel für die Entwicklung neuer Anti-Krebs-Medikamente. Ein Ziel dieser Arbeit ist daher die Entdeckung einer bioaktiven Substanz, welche die Komplexbildung zwischen eIF4A und eIF4G inhibieren könnte. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit ein HTR-FRET-Test (Homogenous Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer, Cisbio Bioassay) entwickelt. Eine Bibliothek von 16544 Substanzen wurde mit diesem Test durchsucht, von denen 252 Substanzen identifiziert wurden; nach der Validierung wiesen einer davon einen IC50-Wert geringer als 10 µM auf. Zentraler Bestandteil des Gerüsts dieser Arbeit ist weiter die Untersuchung der Eigenschaften der Interaktionsfläche von eIF4A und eIF4G. Für ein besseres Verständnis der inhibierenden Wirkungsweise von eIF4GICD auf die eIF4A-Aktivität und der atomaren Grundlagen der Wechselwirkung von eIF4A und eIF4GICD war ein Ziel dieser Arbeit die Kristallisierung des eIF4A:eIF4GICD-Komplexes. Kristalle wurden mittels der Counter Diffusion-Methode erhalten, erzeugten jedoch kein Beugungsmuster an der SLS (Swiss Light Source, Paul Scherrer Institut). Aus diesem Grund wurde die Methode der Oberflächenentropie-Reduktionsmutanten eingeführt, um Cluster von flexiblen Aminosäuren von eIF4GICD zu entfernen. Obwohl sämtliche Cluster generell dasselbe Bindungsverhalten an eIF4A wie der Wildtyp zeigen, bildeten sich in der vorliegenden Untersuchung jedoch keine Kristalle. Die meisten flexiblen Regionen befinden sich in dem C-terminalen Teil von eIF4ICD, weswegen ein verkürztes Konstrukt hergestellt wurde (eIF4GICD(1426)). Bio-Layer-Interferometrie (BLI) wurde durchgeführt, und es wurde ein KD von 300nM für den Komplex eIF4A:eIF4GICD(1426) ermittelt. Weiter wurden sogenannte Sitting-Drop-Kristallisations-Experimente mit dem verkürzten Protein im Komplex mit eIF4A durchgeführt; die gebildeten Kristalle ergaben jedoch keine nutzbaren Diffraktions-eigenschaften. Diese Kristalle wurden zwar durch Seeding verbessert, was aber die Qualität der SLS-Diffraktion nicht dahingehend verbesserte, dass eine Struktur hätte dargestellt werden können. Es ist bekannt, dass eIF4A zwei durch einen Linker miteinander flexibel verbundene Domänen hat, weswegen hierzu auch die Oberflächenentropie-Reduktions-Mutanten hergestellt wurden. Alle Varianten wurden jedoch unlöslich in E. coli exprimiert. Um die Flexibilität von eIF4A zu entfernen, wurde ein S-S-Crosslink konstruiert, um die beiden RecA-ähnlichen Domänen in einer geschlossenen Konformation zu fixieren. Zu diesem Zweck wurden die Aminosäuren Gly-70 (Walker A-Motiv) und Arg-367 (Arginin-Finger) zu Cysteinen mutiert, welche unter oxidativen Bedingungen eine Disulfidbrücke bilden sollten. Diese Annahme konnte durch SDS-Gel-Analyse bestätigt werden. Durch erneute BLI-Studien konnte gezeigt werden, dass die geschlossene Konformation von eIF4A die Bindung zu eIF4GCD verloren hatte. Durch die Zugabe des Reduktionsreagenz DTT konnte jedoch die Bindung vollständig wiederhergestellt werden. Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, dass bei der Komplexbildung eIF4A durch eIF4GICD in der geöffneten Konformation arretiert wird. Eine Interaktion von eIF4GICD mit beiden N-und C-terminalen Domänen von eIF4A wäre also durchaus denkbar. Diese Ergebnisse könnten den molekularen Grund für den regulatorischen Effekt auf die Aktivität von eIF4A und der Translationsinitiation beschreiben. Zukünftige Studien sollten die erhaltenen Substanzen aus dem HTR-FRET-Test näher untersuchen, in Hinblick auf die Affinität chemisch verbessern und mit eIF4A oder eIF4GCD kristallisieren, abhängig davon, an welcher Komponente die Substanz enger bindet. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Borowski, Swantje Heidi Swantje.Zimmermann@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Creators:	Institut für Biochemie AG Baumann
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-64285
Date:	12 November 2015
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language eukaryotischen Initiationsfaktoren, eIF4A, eIF4G, Protein-Portein-Interaktion, HT-FRET German translation initiation factors, eIF4A, eIF4G, Protein-Protein Interaction, HT-FRET-Assay English
Date of oral exam:	26 June 2015
Referee:	Name Academic Title Baumann, Ulrich Prof. Dr. Neundorf, Ines Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6428