Advancing single cell and multiplex cloning strategies to identify broadly neutralizing antibodies targeting infectious pathogens

Lehnen, Nathalie (2022). Advancing single cell and multiplex cloning strategies to identify broadly neutralizing antibodies targeting infectious pathogens. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Multiplex polymerase chain reaction (mPCR) techniques have a versatile use in medicine, as they are implemented for the identification of pathogens and disease biomarkers and are often applied in genotyping. They additionally present a valuable tool for the amplification of lymphocyte receptors (such as antibodies). Fast and efficient methods for the detection and analysis of potent neutralizing antibodies are of tremendous value and are urgently needed for the global prevention and treatment of existing and upcoming infectious diseases, which has been demonstrated vividly in recent years by the epidemic of the human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) and the current severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemic. Although new methods for the analysis of the B cell repertoire and identification of neutralizing antibodies have been subject to many studies in recent years, these processes remain challenging and are highly cost- and labor-intensive. One of the most critical steps in antibody isolation is the two-step mPCR, especially in the presence of high somatic mutation rates, which occur during the antibodies’ affinity maturation and disrupt amplification. Primer design is crucial for a successful mPCR, as amplification of immunological templates is often compromised by primer-template mismatches or unfavorable primer properties and interactions. Thus, the main goal of this thesis was to optimize and further develop mPCR-based single-cell and multiplex cloning strategies for the identification of (broadly) neutralizing antibodies targeting infectious pathogens. We intensively validated and adapted existing BCR amplification concepts to establish a standardized laboratory protocol with cost- and labor intensity optimized conditions. In this context, we introduced the R-based primer design and evaluation tool openPrimeR, which was developed in a collaborative project with the Max Planck Institute Saarbrücken. We used the openPrimeR’s design function to generate promising primer sets capable of amplifying highly mutated antibodies. To enable the testing of the openPrimeR design function in an unbiased experiment setting and refeed gained information back to the program, we developed a standardized immunoglobulin heavy chain variable (IGHV) gene library which represents all 53 human functional IGHV gene segments. The corresponding IGHV gene segments were isolated by 5′-rapid amplification of cDNA-ends polymerase chain reaction (5′ RACE-PCR) from pooled naive B cells of 16 healthy donors. We extensively tested several sets of de novo primers generated by the openPrimeR tool in direct comparison to well-established primer sets on both, antigen-experienced single human B cells and the IGHV gene library. The finally presented optimized oPR(5)-IGHV primer set showed favorable primer set properties, such as exclusive primer binding to the leader region of the V gene to ensure broad template coverage. The oPR(5)-IGHV demonstrated superior performance in amplifying the (germline) IGHV gene library in comparison to established primer sets and is a promising candidate for amplifying highly mutated antibodies. In addition, we were able to generate a large Taq-PCR-based dataset containing the amplification status of 2,820 PCRs (940 triplicates) using a total of 20 different primers on all genes of the IGHV gene library. The data set was analyzed with respect to physicochemical properties of the respective primer-template pairs (PTPs) and their influence on the amplification status. The analysis of our data set identified the free energy of the annealing (∆G), the absolute number of mismatches present in the 3’ hexamer and the mismatch position in relation to the 3’ terminus as determining factors for the amplification status. In summary, the results of this thesis have contributed significantly to the development of a highly effective protocol for the isolation of broadly neutralizing antibodies, which has already been proven successful in the detection of clinically relevant therapeutic antibody candidates.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Optimierung von Einzelzell- und Multiplex-Klonierungsstrategien zur Identifizierung von breit neutralisierenden Antikörpern gegen infektiöse Krankheitserreger	UNSPECIFIED

Translated abstract:

Abstract

Language

Die anhaltende Epidemie des humanen Immundefizienz-Virus-1 (HIV-1) sowie die aktuelle severe acute respiratory syndrome coronavirus 21 (SARS-CoV-2) Pandemie haben deutlich gemacht, dass schnelle und effiziente Methoden zum Nachweis und zur Analyse potenter neutralisierender Antikörper für die globale Prävention und Behandlung bestehender und künftiger Infektionskrankheiten von enormer Bedeutung sind. Obwohl neue Methoden für die Analyse des B-Zell-Repertoires und die Identifizierung und Produktion neutralisierender Antikörper in den letzten Jahren Gegenstand zahlreicher Untersuchungen waren, sind diese Prozesse nach wie vor sehr kosten- und arbeitsintensiv und stellen Wissenschaftler vor große methodische Herausforderungen. Einer der kritischsten Schritte bei der Antikörperisolierung ist die zweistufige multiplex Polymerasekettenreaktion (mPCR), insbesondere bei Vorliegen hoher somatischer Mutationsraten, welche während der Affinitätsreifung der Antikörper auftreten und die Amplifikation stören. Entscheidend für eine erfolgreiche mPCR ist hierbei das Primerdesign, da die Amplifikation von immunologischen Templates häufig durch Primer- Template-Mismatches oder ungünstige Primereigenschaften und -interaktionen beeinträchtigt wird. Das Hauptziel dieser Arbeit war daher die Optimierung und Weiterentwicklung von mPCR-basierten Einzelzell- und Multiplex-Klonierungsstrategien zur Identifizierung von neutralisierenden Antikörpern gegen diverse Infektionserreger. Hierbei lag ein besonderer Fokus auf der Entwicklung eines optimalen Primersets. Um ein standardisiertes und Effizienz-optimiertes Amplifikationsprotokoll zu etablieren, validierten und adaptierten wir bereits bestehende Konzepte. In diesem Rahmen stellten wir das R-basierte Primerdesign- und Auswertungstool „openPrimeR“ vor, welches in einem Kooperationsprojekt mit dem Max-Planck-Institut Saarbrücken entwickelte wurde. Wir verwendeten openPrimeR zum Design von optimierten Primersets für die Amplifikation hochmutierter Antikörper. Um die Effizienz der openPrimeR-Designfunktion zuverlässig bewerten und rückkoppelnd im Programm anpassen zu können, entwickelten wir eine standardisierte Immunoglobulin heavy chain variable region (IGHV)-Genbibliothek, welche alle 53 humanen IGHV-Gensegmente repräsentiert. Die entsprechenden IGHV-Gensegmente wurden durch 5′-rapid amplification of cDNA-ends polymerase chain reaction (5′ RACE-PCR) aus gepoolten, naiven B-Zellen von 16 gesunden Spendern isoliert. Anschließend erfolgten multiple PCR-Amplifikationsexperimente, sowohl auf der neu- etablierten IGHV-Genbibliothek als auch auf humanen naiven und antigen-spezifischen Einzel-B-Zellen. Hierbei erfolgte der direkte Vergleich von mehreren in openPrimeR entworfenen mit bereits etablierten Primersets. Das oPR(5)-IGHV Primerset zeigte im Vergleich zu etablierten Primersets eine überlegene Amplifikationsrate der IGHV- Genbibliothek und ist, insbesondere durch seine exklusive Bindung an die wenig mutierte Leader-Region des V-Gens, ein vielversprechender Kandidat für die Amplifikation hoch mutierter Antikörper. Darüber hinaus konnten wir einen großen Taq-PCR-basierten Datensatz generieren, der den Amplifikationsstatus von 2.820 PCRs (940 Triplikaten) enthält. Dieser wurde mit insgesamt 20 verschiedenen Primern auf allen Genen der IGHV-Genbibliothek erstellt und anschließend hinsichtlich physikalisch-chemischer Eigenschaften der jeweiligen Primer-Template-Paare und deren Einfluss auf den Amplifikationsstatus ausgewertet. Hierbei konnten die freie Energie des Annealings (∆G), die absolute Anzahl der Mismatches innerhalb des 3'-Hexamers sowie die Mismatch-Position im Verhältnis zum 3'-Terminus als entscheidende Faktoren für den Amplifikationsstatus identifizierten werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit trugen wesentlich zur Entwicklung eines hocheffektiven Protokolls zur Identifizierung breit neutralisierender Antikörper bei, welches sich bereits bei der Isolation klinisch relevanter Antikörper-Kandidaten bewährt hat.

UNSPECIFIED

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