Mechanistic Insight into RET Kinase Inhibitors Targeting the DFG-out Conformation in RETrearranged Cancer

Riedel, Maximilian (2017). Mechanistic Insight into RET Kinase Inhibitors Targeting the DFG-out Conformation in RETrearranged Cancer. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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DOI:10.1126/scitranslmed.aah6144

Abstract

RET Fusions-Gene können in 1-2% aller Lungen-Adenokarzinom Patienten nachgewiesen werden. Diese genetischen Veränderungen stellen mittels Tyrosin-Kinase Inhibitoren potentiell therapierbare molekulare Zielstrukturen dar (Pao and Hutchinson 2012), jedoch haben klinische Studien im Jahr 2018 für diese Lungenkarzinome bisher noch keine ausreichend erfolgreichen Therapieansätze zeigen können (Drilon et al. 2018). Um systematisch das therapeutische Profil von AD80 und einer Vielzahl weiterer Tyrosinkinase Inhibitoren gegen RET-Fusion getriebene Zellmodelle auswerten zu können, habe ich zunächst Ba/F3 Zellen viral mit KIF5B-RET sowie CCDC6-RET transduziert. Das Wachstum von Ba/F3 Zellen in vitro ist im Normalzustand abhängig von IL-3. Sobald sie mit einem starken Onkogen jedoch transduziert werden, sind sie unabhängig von IL-3 und proliferieren nur noch abhängig von der Aktivität des entsprechenden Onkogens. Durch dieses Modelsystem konnte ich eine große Anzahl verschiedener Inhibitoren gegen RET testen und ihre Potenz untereinander vergleichen. Die selbst etablierten Ba/F3 Zell-Linien zusammen mit der RET-Fusion getriebenen Lungen-Adenokarzinom Zelllinie LC-2/AD bildeten den Ausgangspunkt für mein Projekts. Zusätzlich habe ich ein endogen RET-mutiertes Zell-Model mittels der Genom-Editierungstechnik CRISPR/Cas9 etabliert. Dafür habe ich einen Vektor mit Cas9 mRNA sowie zwei Promotoren für die Expression von spezifischen „single-guided RNAs“ (sgRNA) kloniert und murine Fibroblast Zellen (NIH-3T3) transfiziert. Mittels sgRNAs gegen die jeweiligen spezifischen Introns von RET und KIF5B konnte ich somit in selektionierten NIH-3T3 Zellen KIF5B-RET Translokationen generieren. Indem ich diese neu etablierten Zelllinien zusammen mit einer größeren Anzahl humaner Lungenkrebs Zell-Linien gegen potentielle RET-Inhibitoren getestet habe, konnte ich die klinische Erfahrung in vitro bestätigen, dass die zurzeit gängigen Therapieansätze mit Tyrosinkinase- Inhibitoren wie z.B. Cabozantinib, Alectinib oder Vandetanib wahrscheinlich eine nicht ausreichend hohe therapeutische Potenz besitzen, um eine effektive Wirkung auf RET getriebene Tumore zu entwickeln. Weiterhin deuteten die Daten darauf hin, dass andere Tyrosin-Kinase Inhibitoren, wie z.B. AD80 und Ponatinib, im Vergleich dazu 100 bis 1000-fach potenter sind und spezifisch die RET-Kinase inhibieren. Als nächstes habe ich die Unterschiede in den Zell-Viabilitäts-Assays mit den Veränderungen auf der Protein-Ebene zu verglichen. Die folgenden Western Blot und Phosphoproteom Analysen haben eine entsprechende Reduktion in phospho-RET und den weiteren nachgeschalteten Signal-Molekülen gezeigt. Zusätzlich haben die in vivo Ergebnisse unserer CCDC6-RET PDX-Mausmodelle unsere in vitro Daten mit gutem Tumoransprechen unter Therapie mit AD80 bestätigt. Parallel zu meiner Arbeit für das Projekt haben wir mit anderen Arbeitsgruppen zusammengearbeitet, um ein tieferes Verständnis über die funktionellen Mechanismen hinter der hohen Aktivität von AD80 gegen RET zu erhalten. Mittels computerbasierter Modelle haben wir ableiten können, dass AD80 mit hoher Wahrscheinlichkeit als Typ II Inhibitor die RET-Kinase in der inaktiven „DFG-out“ Konformation bindet, was mit einer erhöhten Kinase- Thermostabilität im Vergleich zu Typ I Inhibitoren als Bindungspartner einhergeht. Dies wiederum ist ein Surrogat-Parameter für eine engere Kinase-Bindung durch die Inhibitoren und könnte eine mögliche Erklärung für die hohe Cytotoxitität in unseren Experimenten sein. Im Folgenden hat sich das Projekt mehr auf die Rolle von Resistenz-Mechanismen in RET mutierten Zelllinien konzentriert. Mittels zielgerichteter Mutagenese (site-directed mutagenesis) habe ich an der sogenannten „Gatekeeper Position“ mutierte Ba/F3 KIFRETV804M und CCDC6-RETV804M etablieren können, um die Wirksamkeit der Inhibitoren dagegen zu testen. Wieder zeigten AD80 und Ponatinib den stärksten inhibitorischen Effekt gegen RET mit nur einer geringen Reduktion der Cytotoxitität in den Zell-Viabilitäts-Assays und RET-Dephosphorylierung im Vergleich zu RETwt. Mittels Sättigungsmutagenese (saturated mutagenesis screening) habe ich versucht, Resistenzmutationen zu finden, die neben der bekannten „Gatekeeper Position“ pV804M zur Resistenz gegen AD80 führen könnten. Es zeigte sich in der Sequenzierung von resistenten Ba/F3CCDC6-RET Zellen die missense Mutation pI788N (c.2363T>A) im Bereich der RET-Kinase Domäne als potentielle sekundäre Resistenzmutation unter Therapie mit AD80. Diesen Resistenz-Effekt durch die neue Mutation konnte ich dann in den folgenden zellulären Modellen mittels Zell-Viabilitäts-Assays und Western Blots bestätigen. Zusätzlich haben Ergebnisse einer sekundär gegen AD80 resistent gewordenen TPC-1 Schilddrüsenkarzinom-Zelllinie sowie RNASequenzierungen von LC-2/AD Zelllinien unter Therapie gegen AD80 ergeben, dass MAPKReaktivierung potentiell eine Rolle als Resistenz-Mechanismus in RET-getriebenen Tumoren besitzen könnte. Um formell die Rolle von MAPK-Reaktivierung in Bezug auf Resistenz-Effekte zu testen, wurden LC-2/AD Zellen von mir lentiviral mit KRASG12V transduziert, was zu einer Überexprimierung von KRAS und zu einer folgenden Resistenz gegen die Behandlung mit AD80 geführt hat. Für Ponatinib gibt es bereits klinische Phase 3 Studien an Patienten mit Chronisch Myeloischer Leukämie, die jedoch trotz gutem initialen Tumor Ansprechen aufgrund von erhöhten Therapie assoziierten Komplikationen beendet werden musste (Lipton et al. 2016). Der RET-Kinase Inhibitor AD80 wäre daher ein geeigneter Kandidat für zukünftige klinische Studien. Bedenkt man den hohen Bedarf an neuen, wirksamen und verträglichen Therapieansätzen im Rahmen der individualisierten Lungenkarzinom-Therapie, bietet unsere Studie eine Vielzahl neuer mechanistischer Einsichten in die aktuelle anti-RET Therapie und trägt zur deren zukünftigen Entwicklung bei.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Creators: