Universität zu Köln

Petrov, Dimitar Plamenov (2015). Regulation of the phosphotransferase system (PTS)-mediated sugar uptake in Corynebacterium glutamicum in response to perturbations of the central metabolism. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Corynebacterium glutamicum is a Gram-positive bacterium used in the biotechnological production of amino acids. It co-metabolizes most substrates, such as glucose and sucrose. The uptake and concomitant phosphorylation of those two substrates is mediated by the phosphoenolpyruvate (PEP)-dependent phosphotransferase system (PTS), consisting of the common proteins HPr and EI, and an array of substrate-specific EII permeases. The PTS plays a central role in the regulation of nutrient uptake and metabolism in bacteria. However, the regulatory functions of the PTS in C. glutamicum are not understood. As the availability of NADPH is a limiting factor for the biosynthesis of amino acids, the deletion of pgi, encoding the enzyme phosphoglucoisomerase, is a promising approach for strain improvement. It blocks the first step of glycolysis and directs the glucose-derived carbon flux towards the NADPH-producing pentose phosphate pathway. However, despite that C. glutamicum Δpgi grows well with sucrose as a sole carbon source, addition of glucose arrests growth by causing repression of ptsS, encoding the sucrose-specific EIIsuc, and a drastic sucrose uptake inhibition. The regulatory mechanism behind these phenomena was unknown and has been investigated here. It was shown that the glucose addition inhibits sucrose uptake in C. glutamicum Δpgi prior to ptsS-repression and this fast process is not prevented by transcriptional or translational inhibitors. Analysis of the phosphorylation state of HPr - the last common component of the PTS phosphorylation cascade - indicated that the uptake inhibition is caused by a rapid depletion of HPr~P. The addition of non-PTS substrates which generate carbon flux towards glucose-6-P like e.g. maltose or glucose-6-P, uptake of which was enabled by the heterologously expressed transporter UhpT, led to similar growth and sucrose uptake inhibition as the addition of glucose. Unlike glucose, those substrates do not consume PEP for their uptake, so that the HP~P depletion is not caused by a decrease of the PEP/pyruvate ratio but by a glucose-6-P stress response mechanism. Perception of the glucose-6-P stress and the following response initiation requires the glucose-specific EIIglc as in EIIglc-deficient pgi mutants sucrose uptake was not inhibited by glucose, glucose-6-P or maltose addition. Further, it was shown that the low ptsS-mRNA levels observed in C. glutamicum Δpgi after glucose addition are a consequence of transcriptional repression by the regulator SugR. EMSA studies indicated fructose-1-P and to a lesser extent fructose-6-P as inhibitors of the SugR binding to the ptsS-promoter region. Taken together, this work shows that EIIglc is part of a novel mechanism for the perception of sugar-P stress which leads to instantaneous inhibition of the PTS phosphorylation cascade and consequently PTS activity in C. glutamicum. Additionally, this rapid uptake inhibition leads to low fructose-1-P formation and thus by an inducer exclusion mechanism, to SugR-dependent reduction of ptsS-expression. A suppressor mutation in the gene cg0790 (lpdA) was found to improve significantly the growth, sucrose uptake and ptsS-expression of C. glutamicum Δpgi during cultivation in the presence of glucose. The role of the novel regulatory mechanism for PTS regulation in C. glutamicum is also discussed.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Corynebacterium glutamicum ist ein Gram-positives Bakterium, das für die biotechnologische Herstellung von Aminosäuren verwendet wird. Es co-verstoffwechselt die meisten Substrate, wie z. B. Glucose und Saccharose. Die Aufnahme und gleichzeitige Phosphorylierung dieser zwei Substrate wird vom Phosphoenolpyruvat (PEP)-abhängigen Phosphotransferase System (PTS) vermittelt, bestehend aus den allgemeinen Komponenten HPr und EI und mehreren substratspezifischen EII Permeasen. Das PTS spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation der Nahrungsaufnahme und Metabolismus in Bakterien. Jedoch sind die regulatorischen Funktionen des PTS in C. glutamicum nicht verstanden. Die Verfügbarkeit an NADPH ist ein limitierender Faktor für die Biosynthese von Aminosäuren, sodass die Deletion von pgi, welches das Enzym Phosphoglucoisomerase kodiert, ein vielversprechender Ansatz zur Stammverbesserung ist. Dabei wird der erste Schritt der Glykolyse blockiert und der Glucose-abgeleitete Kohlenstofffluss wird in Richtung des NADPH-erzeugenden Pentosephosphatwegs gelenkt. C. glutamicum Δpgi wächst gut mit Saccharose als einziger Kohlenstoffquelle, doch Zugabe von Glukose führt zur Wachstumshemmung, indem die Expression von ptsS, das die Saccharose-spezifische EIISuc kodiert, und die Saccharoseaufnahme gehemmt werden. Der regulatorische Mechanismus hinter diesen Phänomenen war unbekannt und wurde hier untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Saccharoseaufnahme in C. glutamicum Δpgi durch Glucosezugabe sofort und vor der ptsS-Repression inhibiert wird und dass dieser Prozess transkriptions- und translationsunabhängig ist. Die Analyse des Phosphorylierungszustandes von HPr - die letzte gemeinsame Komponente der PTS Phosphorylierungskaskade - zeigte, dass die Aufnahmehemmung durch eine schnelle Erschöpfung von HPr~P verursacht wird. Die Zugabe von nicht-PTS Substraten die zur Bildung von Glucose-6-P führen, wie z. B. Maltose oder Glucose-6-P, dessen Aufnahme durch heterologe Expression vom Transporter UhpT ermöglicht wurde, führte zur ähnlichen Wachstums- und Saccharoseaufnahmehemmung wie die Zugabe von Glucose. Im Gegensatz zu Glukose verbrauchen diese Substrate kein PEP für ihre Aufnahme, so dass die Erschöpfung von HP~P nicht durch Verringerung des PEP/Pyruvat-Verhältnisses, sondern von einem Glucose-6-P Stressantwort Mechanismus verursacht wird. Die Wahrnehmung des Glucose-6-P Stresses und die folgende Initiation der Stressantwort erfordert die glukosespezifische EIIGlc als in EIIGlc-defizienten pgi Mutanten die Saccharoseaufnahme durch Glucose, Glucose-6-P oder Maltose nicht inhibiert wurde. Weiterhin wurde gezeigt, dass das die Abnahme der ptsS-mRNA Mengen in C. glutamicum Δpgi nach Glucosezugabe eine Folge der transkriptionellen Repression von ptsS durch den Reglulator SugR ist. Des Weiteren zeigten EMSA-Studien Fruktose-1-P und Fructose-6-P als Inhibitoren der SugR-Bindung an die ptsS-Promotorregion. Zusammengenommen zeigt diese Arbeit, dass EIIGlc Teil eines neuen Mechanismus für die Wahrnehmung von Zucker-P Stress ist, der zur sofortigen Hemmung der PTS Phosphorylierungskaskade und damit der PTS-Aktivität in C. glutamicum führt. Darüber hinaus führt diese schnelle Aufnahmehemmung zur verringerten Fructose-1-P Bildung und damit nach einem inducer exclusion Mechanismus zur SugR-abhängigen ptsS-Repression. Schließlich wurde hier auch eine Suppressormutation im Gen cg0790 (lpdA) gefunden, die das Wachstum, die Saccharose-Aufnahme und die ptsS-Expression von C. glutamicum Δpgi während einer Kultivierung in Gegenwart von Glucose deutlich verbessert. Die Rolle des neuen Regulationsmechanismus für die PTS Regulierung in C. glutamicum wird diskutiert. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Petrov, Dimitar Plamenov mit_pp@yahoo.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-64805
Date:	25 April 2015
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language corynebacterium; glutamicum; PTS; phosphotransferase system; regulation; phosphostress; sugar; sucrose; glucose; pgi; phosphoglucoisomerase; PEP; metabolism, sugar uptake English corynebacterium; glutamicum; PTS; Phosphotransferase System; Regulation; Phosphostress; Zucker; Sucrose; Glucose; pgi; Phosphoglucoisomerase; PEP; Metabolism, Zuckeraufnahme German
Date of oral exam:	18 June 2015
Referee:	Name Academic Title Schnetz, Karin Prof. Dr. Krämer, Reinhard Prof. Dr. Flügge, Ulf-Ingo Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6480