Universität zu Köln

Shen, Yefeng ORCID: 0000-0002-6565-1117 (2023). CircRNAs from LSD1 regulate alternative splicing of its parental gene by R-loop formation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Lung cancer is one of the most common malignancies worldwide, with lung adenocarcinoma (LUAD) being the most common subtype. There is growing evidence that epigenetics plays a critical role in cancer initiation and development, including the key regulator lysine-specific demethylase 1 (LSD1). LSD1 regulates gene expression by demethylating histone 3 lysine 4 and lysine 9, and its high expression correlates with poor prognosis in cancer patients. Several alternative LSD1 splice variants of exon 2a and 8a are expressed, but the regulatory mechanisms are unclear. Because splicing may compete with back-splicing processes that generate circular RNAs (circRNAs), in my thesis I focused on LSD1 splice variants and circRNAs from the LSD1 gene in LUAD. According to data from the TCGA database, the levels of LSD1+2a variants containing exon 2a differed but compared with total LSD1 transcripts - only slightly between LUAD and adjacent non-tumor tissues. Among the most highly regulated circRNAs from LUAD cells PC9 and normal lung epithelial cells PSAE, two circRNAs originating from the LSD1 gene were identified. PCR studies using different primers of exon 2 identified circRNAs derived from LSD1 (circRNA 3_2_2a, circRNA 3_2, and circRNA 2a_2). Fluorescence in situ hybridization (FISH) and qPCR revealed that circRNA 3_2_2a, circRNA 3_2, and circRNA 2a_2 were presented in the nucleus and cytoplasm. Silencing of circRNA 2a_2 by siRNA but not circRNA 3_2_2a and circRNA 3_2 resulted in a linear LSD1+2a mRNA decrease in A549 and PC9 cells. In addition, overexpression of circRNA 3_2_2a and circRNA 3_2 resulted in upregulation of LSD1+2a in PC9 cells, and overexpression of circRNA 3_2_2a and circRNA 2a_2 increased LSD1+2a levels in PSAE cells. Pull-down experiments with S9.6 antibody recognizing R-loops showed that R-loops are formed in response to circRNA 3_2_2a and circRNA 2a_2 overexpression and that they bind to the paternal genomic DNA locus of LSD1. RNase H/R treatment of the purified RNA confirmed our findings on circRNA interaction. In particular, knockdown and overexpression of circRNA 8a_2, newly identified in the present study, affected the expression of the LSD1+8a alternative splice variant carrying exon 8a. The neurospecific LSD1+8a isoform was found to be specifically expressed in small cell lung cancer (SCLC) cells and its suppression impaired SCLC cell viability. Importantly, overexpression of circRNA 8a_2 induced LSD1+8a expression even in normally LSD1+8a-negative LUAD cells. In summary, these results show that circRNA originating from the exon 2/2a region or from the 8/8a region affect the alternative splicing of the respective exons in the linear LSD1 transcript by R-loop formation. Because the alternative splice variants differ in LSD1 demethylation activity, circRNA expression is hypothesized to affect LSD1 function in cancer.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language CircRNAs from LSD1 regulate alternative splicing of its parental gene by R-loop formation English
Translated abstract:	Abstract Language Lungenkrebs ist eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen weltweit, wobei das Adenokarzinom der Lunge (LUAD) der häufigste Subtyp ist. Es gibt immer mehr Belege dafür, dass die Epigenetik eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und Entwicklung von Krebs spielt, darunter auch der wichtige Regulator Lysin-spezifische Demethylase 1 (LSD1). LSD1 reguliert die Genexpression durch Demethylierung von Histon 3 Lysin 4 und Lysin 9. Seine hohe Expression korreliert mit einer schlechten Prognose bei Krebspatienten. Es werden verschiedene alternative LSD1-Spleißvarianten von Exon 2a und 8a exprimiert, aber die Regulationsmechanismen sind unklar. Da das Spleißen mit Back-Splicing-Prozessen konkurrieren kann, die zirkuläre RNAs (circRNAs) erzeugen, habe ich mich auf LSD1-Spleißvarianten und circRNAs aus dem LSD1-Gen bei LUAD konzentriert. Den TCGA-Daten zufolge unterschieden sich die Spiegel der LSD1+2a-Varianten, die das Exon 2a enthalten, im Vergleich zu den gesamten LSD1-Transkripten zwischen LUAD und angrenzenden Nicht-Tumorgeweben nur geringfügig. Unter den am stärksten regulierten circRNAs von LUAD-Zellen PC9 und normalen Lungenepithelzellen PSAE wurden zwei circRNAs identifiziert, die vom LSD1-Gen stammen. PCR-Studien mit divergenten Primer von Exon 2 identifizierten circRNAs, die von LSD1 abgeleitet sind (circRNA 3_2_2a, circRNA 3_2 und circRNA 2a_2). Durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und qPCR wurde festgestellt, dass circRNA 3_2_2a, circRNA 3_2 und circRNA 2a_2 im Zellkern und im Zytoplasma exprimiert wurden. Das Silencing von circRNA 2a_2 durch siRNA, aber nicht von circRNA 3_2_2a und circRNA 3_2 führte zu einer linearen LSD1+2a mRNA-Abnahme in A549- und PC9-Zellen. Darüber hinaus resultierte die Überexpression von circRNA _2_2a und circRNA 3_2 zu einer Hochregulierung von LSD1+2a in PC9-Zellen und die Überexpression von circRNA 3_2_2a und circRNA 2a_2 erhöhte die LSD1+2a-Spiegel in PSAE-Zellen. Pull-Down-Experimente mit dem S9.6-Antikörper, der R-Loop-Bildungen erkennt, zeigten, dass als Reaktion auf die circRNA 3_2_2a- und circRNA 2a-2-Überexpression R-Loops gebildet werden und dass sie an den paternalem genomischen DNA-Locus des LSD1 binden. Die RNase H/R-Behandlung der gereinigten RNA bestätigte unsere Ergebnisse zur circRNA-Interaktion. Insbesondere der knockdown und die Überexpression der circRNA 8a_2, die in der vorliegenden Studie neu identifiziert wurde, beeinflusste die Expression der alternativen LSD1+8a-Spleißvariante, die Exon 8a trägt. Es wurde festgestellt, dass die neurospezifische LSD1+8a-Isoform spezifisch in kleinzelligen Lungenkrebszellen (SCLC) exprimiert wird und dass ihre Unterdrückung die Lebensfähigkeit von SCLC-Zellen beeinträchtigt. Wichtig ist, dass die Überexpression der circRNA 8a_2 die Expression von LSD1+8a sogar in normalerweise LSD1+8a-negativen LUAD-Zellen induzierte. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass circRNA, die aus der Exon 2/2a-Region oder aus der 8/8a-Region stammen, das alternative Spleißen der jeweiligen Exons im linearen LSD1-Transkript durch R-Schleifenbildung beeinflussen. Da sich die alternativen Spleißvarianten in der LSD1-Demethylierungsaktivität unterscheiden, wird angenommen, dass die circRNA-Expression die LSD1-Funktion bei Krebs beeinflusst. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Shen, Yefeng shenyefeng2015@gmail.com orcid.org/0000-0002-6565-1117 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-650284
Date:	28 February 2023
Language:	English
Faculty:	Faculty of Medicine
Divisions:	Faculty of Medicine > Pathologie und Neuropathologie > Institut für Pathologie
Subjects:	Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language circRNA English LSD1 English alternative splicing English R-loop English parental gene English
Date of oral exam:	10 January 2023
Referee:	Name Academic Title Gehring, Niels Prof. Dr. Schweiger, Michal Ruth Prof. Dr. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/65028