Universität zu Köln

Heger, Eva (2015). Analyse des mutagenen Einflusses von APOBEC auf den Tropismus von HIV-1. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Bei der Infektion von Zielzellen bindet HIV außer an CD4 auch die Korezeptoren CCR5 oder CXCR4, weshalb die Viren in CCR5- (R5) und CXCR4-trope Viren (X4) eingeteilt werden. Während CCR5-trope Viruspopulationen in frühen Stadien der Infektion dominieren, können diese später von CXCR4-tropen Varianten verdrängt werden. Die genauen Mechanismen, die zum Entstehen von X4-Viren führen, sind bislang noch ungeklärt. Infizierte Zellen exprimieren eine Vielzahl von Restriktionsfaktoren, um die Replikation von Viren zu verhindern. Die zellulären Restriktionsfaktoren APOBEC3G und APOBEC3F besitzen eine Cytidin-Deaminase-Aktivität, durch die G-zu-A Mutationen im proviralen HIV-Genom während der Reversen Transkription entstehen. Bei uneingeschränkter Aktivität führt APOBEC zu einer letalen Hypermutation des viralen Genoms. HIV schützt sich vor der antiviralen Aktivität APOBECs durch das akzessorische Protein Vif. Als Gegenspieler von APOBEC ist Vif in der Lage, dessen Aktivität durch Induktion der 26S proteasomalen Degradation zu neutralisieren. Schwache APOBEC-Aktivitäten, wie sie bei Vif-defizienten Varianten entstehen können, erhöhen die Variabilität von HIV. In dieser Arbeit wurde der mutagene Einfluss APOBECs und die modulierende Wirkung von Vif in seiner Auswirkung auf den Tropismus von HIV untersucht. Sequenzen von HIV mit definiertem Tropismus wurden zunächst auf APOBEC-spezifische Sequenzunterschiede hin analysiert. Die Analyse von 1553 V3-Sequenzen, der Tropismus-determinierenden Region, zeigte eine höhere Anzahl von APOBEC-Motiven in R5- als in X4-Sequenzen. Zusätzlich konnten, vorwiegend an Korezeptor-relevanten Positionen, Unterschiede in den kodierenden Tripletts der R5- und X4-Viren detektiert werden, die auf APOBEC-induzierte G-zu-A Mutationen zurückgeführt werden können. Ein Vergleich der Nukleotid-Substitutionen zwischen R5- und X4-Sequenzen zeigte die G-zu-A Substitution als häufigste Nukleotid-Substitution an. Auch in den longitudinalen Sequenzdaten konnte ein beginnender Tropismuswechsel von R5 zu X4 mit der Zunahme der G-zu-A Mutationen in APOBEC-Erkennungsmotiven in Verbindung gebracht werden. Diese Daten unterstützen die Hypothese einer Beteiligung der APOBEC-Proteine A3G und A3F als mutationsfördernde Faktoren bei der Entstehung von X4-Varianten und somit am Korezeptorswitch. Diese Hypothese wurde anhand von zwei Zellkultursystemen überprüft. Dazu wurden Tet-induzierbare A3F- bzw. A3G-Expressionssysteme generiert, die die unabhängige Analyse des mutagenen Einflusses von A3G bzw. A3F auf verschiedene HIV-Vif-Varianten ermöglichten. Durch die Verwendung von PBMC-Kulturen mit unterschiedlichen endogenen APOBEC-Konzentrationen konnte die additive Wirkung von A3G und A3F auf HIV analysiert werden. In beiden Systemen wurde die Replikation des Vif-kompetenten Wildtyps nicht beeinflusst Die Replikation der Vif-defizienten Varianten wurde dagegen, in Abhängigkeit von der APOBEC-Menge und der Neutralisationsfähigkeit von Vif unterschiedlich stark inhibiert. Mittels hochauflösender Sequenzanalyse (next generation sequencing) des V3-Bereichs konnten Unterschiede in den G-zu-A Mutationsfrequenzen der nachfolgenden Virusgenerationen beobachtet und mit den APOBEC-Aktivitäten assoziiert werden. In beiden Zellkultursystemen offenbarten Tropismus-Vorhersagesysteme eine Zunahme an X4-Varianten in den stärker Vif-defizienten Viruspopulationen. Dieser Anstieg der X4-Varianten konnte mit einer Zunahme der G-zu-A Mutationsfrequenz im A3F-Motiv an Position 25 assoziiert werden. Basierend auf den G-zu-A Mutationshäufigkeiten pro APOBEC-Motiv wurden Mutationsraten ermittelt, die einen Vif-abhängigen Anstieg zeigten und somit die APOBEC-Vif-Interaktionen widerspiegeln. Ein Vergleich der Mutationsraten nach APOBEC-Motiv und HIV-Region bestätigte die höhere mutagene Aktivität von A3G gegenüber A3F ebenso wie die Auswirkung der APOBEC-Expositionsdauer während der Reversen Transkription. Nef ist während der reversen Transkription der mutagenen APOBEC-Aktivität länger ausgesetzt als env und zeigt auch eine höhere Mutationsrate als env. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit durch kontrollierte APOBEC-Vif-Interaktionen der mutagene Einfluss der APOBEC-Proteine auf HIV gezeigt und als möglicher Mechanismus für die Entstehung CXCR4-troper HI-Virusvarianten identifiziert werden.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language HIV infects its target cells by binding to CD4 and either CCR5 or CXCR4 as coreceptors. Accordingly, two classes of virus have been defined on the basis of their coreceptor preference, CCR5-tropic (R5) and CXCR4-tropic (X4) viruses. While R5 tropic viruses dominate at early stages of infection, they are outgrown by X4 viruses during later stages. The molecular mechanisms leading to the emergence of X4-viruses are not understood so far. Infected cells express a number of restriction factors to control viral replication. The cellular restriction factors APOBEC3G and APOBEC3F carry cytidine deaminase activity resulting in G to A transitions in newly generated proviral DNA. Unrestricted APOBEC activity leads to a lethal hypermutation of the viral genomes. The HIV accessory protein Vif counteracts the antiviral activity of APOBEC by mediating its degradation in the 26S proteasome. Restricted APOBEC activities, as induced by Vif variants can increase HIV variability. In this study, the mutagenic impact of APOBEC and the modulating effect of Vif on the tropism of HIV was examined. Previously established sequences from viruses with known tropism were analysed at first with respect to APOBEC-specific differences. The analysis of 1553 sequences corresponding to the V3 region, the main determinant of tropism, revealed a higher number of APOBEC motifs in R5 versus X4 sequences. Additionally, we found differences in the coding triplets between R5 and X4 viruses at coreceptor relevant positions, which could be attributed to APOBEC-induced mutations. A comparison of the nucleotide substitutions between R5 and X4 sequences identified G-to-A substitutions as the most common substitutions. In the longitudinal sequence data, G-to-A mutations at APOBEC recognition motifs could be associated with the onset of tropism switch confirming the findings of the cross-sectional data. Taken together, these results support the hypothesis that A3G and A3F are involved in the coreceptor switch by promoting the emergence of X4 variants during the course of infection. This hypothesis was then tested experimentally in two cell culture systems. For this purpose, Tet-inducible cell culture systems expressing A3F and A3G, respectively, were generated. Upon infection with various HIV Vif variants, A3G- or A3F-induced mutation patterns in the V3 region of the newly produced virus generation could be analysed precisely. In contrast, PBMC cultures with different endogenous APOBEC levels enabled the analysis of the additive effect of A3G and A3F on HIV. While replication of the Vif-competent wild-type virus was not altered in both systems, the replication of Vif-deficient variants was inhibited depending on the APOBEC expression level and the neutralization activity of Vif. Using high-resolution sequence analysis (next generation sequencing) of the V3 region, differences in the G-to-A mutation frequencies of the subsequent virus population could be observed and associated with the APOBEC activities depending on Vif-deficiency. In both cell culture systems, an increase of X4 variants in the more Vif-deficient virus populations was calculated via coreceptor prediction tools. The X4-increment may be ascribed to the frequent G-to-A mutations in the A3F motif at position 25. Mutation rates calculated by the G-to-A mutation frequencies per motif increase in a Vif-dependent manner and reflected the effects of the APOBEC-Vif interaction in PBMC-virus cultures. Mutation rates analysed with respect to APOBEC motif and HIV region confirmed the higher mutagenic activity of A3G versus A3F as well as the impact of APOBEC-exposure during reverse transcription. This was evident by a higher mutation rate in nef compared to the env region, as nef is exposed longer to APOBEC activity during reverse transcription. In summary, defined APOBEC-Vif interaction shows the mutagenic effect of APOBEC proteins on HIV and reveals APOBEC-mediated G-to-A mutation as a possible mechanism for the emergence of CXCR4-tropic HIV variants. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Heger, Eva eva.heger@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-65052
Date:	2015
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Virologie > Institut für Virologie
Subjects:	Natural sciences and mathematics Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language HIV, APOBEC, Tropismus, Korezeptor, G-zu-A Mutation German HIV, APOBEC, tropism, coreceptor, G-to-A mutation English
Date of oral exam:	22 January 2015
Referee:	Name Academic Title Roth, Siegfried Prof. Dr. Pfister, Herbert Prof. Dr. Dr. h. c.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6505