Universität zu Köln

Delle Vedove, Andrea ORCID: 0000-0003-4771-9808 (2023). Identification and Functional Assessment of Novel Neuromuscular Disease-Causing Genes. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Inherited neuromuscular diseases comprise a highly heterogeneous group of disorders characterized by the impairment of the neural structures or motor unit components responsible for the generation of movement. While as single gene-associated disorder the majority of them are rare, taken together their estimated prevalence reaches 1 – 3 cases / 1000 individuals. Due to their elevated morbidity and mortality, they represent a significant health burden for the affected individuals, their families, and the healthcare systems. Moreover, their clinical and genetic heterogeneity makes their diagnosis a long and complex process, which often requires specialized diagnostic procedures and poses a challenge in about half of the cases. However, thanks to decreasing costs and increased availability of next-generation sequencing technologies, the last years had witnessed a rise in the number of novel genes associated to neuromuscular disorders. In this study, we identified three novel neuromuscular disease-causing genes: PIEZO2, whose biallelic loss-of-function mutations cause distal arthrogryposis with impaired proprioception and touch; VAMP1, whose biallelic loss-of-function mutations cause a novel presynaptic congenital myasthenic syndrome; CAPRIN1, whose specific p.Pro512Leu mutation causes a neurodegenerative disorder characterized by ataxia and muscle weakness. For PIEZO2, we identified biallelic loss-of-function mutations using exome sequencing, SNPchip-based linkage analysis, DNA microarray, and Sanger sequencing in ten affected individuals of four independent families showing arthrogryposis, hypotonia, respiratory insufficiency at birth, scoliosis, and delayed motor development. This phenotype is clearly distinct from distal arthrogryposis with ocular anomalies which characterize the autosomal dominant distal arthrogryposis 3 (DA3), distal arthrogryposis 5 (DA5), and Marden-Walker syndrome (MWKS). While these disorders are caused by heterozygous gain-of-function mutations in PIEZO2, the novel reported mutations result in the loss of PIEZO2, since they lead to nonsense-mediated mRNA decay in patient-derived fibroblast cell lines. PIEZO2 is a mechanosensitive ion channel playing a major role in light-touch sensation and proprioception. Mice ubiquitously depleted of PIEZO2 die postnatally because of respiratory distress, while individuals lacking PIEZO2 develop a neuromuscular disorder, likely due to the loss of proprioception inputs in muscles. For VAMP1, we identified biallelic loss-of-function mutations using exome or genome sequencing in two pairs of siblings from two independent families affected by a novel congenital myasthenic syndrome. Electrodiagnostic examination showed severely low compound muscle action potentials and presynaptic impairment. The two described homozygous mutations are a frameshift and a missense mutation of a highly conserved residue, therefore are likely to result in the loss of VAMP1 function. Indeed, the phenotype is resembled by VAMP1lew/lew mice, which carry a homozygous VAMP1 truncating mutation and show neurophysiological features of presynaptic impairment. For CAPRIN1, we identified the identical de novo c.1535C>T (p.Pro512Leu) missense variant using trio exome sequencing in two unrelated individuals displaying early-onset ataxia, dysarthria, cognitive decline and muscle weakness. This mutation causes the substitution of a highly conserved residue and in silico tools predict an increase in the protein aggregation propensity. Overexpression of CAPRIN1-P512L caused the formation of insoluble ubiquitinated aggregates, sequestrating proteins associated with neurodegenerative disorders, such as ATXN2, GEMIN5, SNRNP200, and SNCA. Upon differentiation in cortical neurons of induced pluripotent stem cell (iPSC) lines where the CAPRIN1-P512L was introduced via CRISPR/Cas9, reduced neuronal activity and altered stress granules dynamics were observed in the lines harboring the mutation. Moreover, nano-differential scanning fluorimetry revealed that CAPRIN1-P512L adopts an extended conformation, and fluorescence microscopy demonstrated that RNA greatly enhances its aggregation in vitro. Taken together, this study associates: (1) biallelic loss-of-function mutations in PIEZO2 with the autosomal recessive distal arthrogryposis with impaired proprioception and touch; (2) biallelic loss-of-function mutations in VAMP1 with an autosomal recessive presynaptic congenital myasthenic syndrome; (3) a recurrent de novo p.Pro512Leu mutation of CAPRIN1 with a neurodegenerative disorder characterized by ataxia and muscle weakness.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Erbliche neuromuskuläre Erkrankungen umfassen eine sehr heterogene Gruppe von Krankheiten, welche durch eine Beeinträchtigung der neuronalen Strukturen oder der Komponenten der motorischen Einheiten, die für die Erzeugung von Bewegungen verantwortlich sind, charakterisiert sind. Während die meisten von ihnen als gen-assoziierte Einzelerkrankungen selten sind, liegt die geschätzte Prävalenz der gesamten Krankheitsgruppe bei 1 - 3 Fällen / 1000 Menschen. Aufgrund ihrer hohen Morbidität und Mortalität stellen sie eine erhebliche gesundheitliche Belastung für die betroffenen Personen, ihre Familien und die Gesundheitssysteme dar. Darüber hinaus macht ihre klinische und genetische Heterogenität die Diagnosestellung zu einem langwierigen und komplexen Prozess, der häufig spezielle Diagnoseverfahren erfordert und in etwa der Hälfte der Fälle immer noch eine Herausforderung darstellt. Dank sinkender Kosten und der zunehmenden Verfügbarkeit von „next-generation“ Sequenzierungstechnologien konnte in den letzten Jahren jedoch ein Anstieg neuer Gene verzeichnet werden, die mit neuromuskulären Störungen in Verbindung gebracht werden konnten. In dieser Studie haben wir drei neue Gene, die neuromuskuläre Erkrankungen verursachen, identifiziert: PIEZO2, dessen biallelische Loss-of-function-Mutationen eine distale Arthrogrypose mit beeinträchtigter Propriozeption und Tastsinn verursachen; VAMP1, dessen biallelische Loss-of-function-Mutationen ein neuartiges präsynaptisches kongenitales myasthenisches Syndrom verursachen; und CAPRIN1, dessen spezifische p.Pro512Leu-Mutation eine neurodegenerative Störung verursacht, die durch Ataxie und Muskelschwäche gekennzeichnet ist. Für PIEZO2 identifizierten wir biallelische Loss-of-function-Mutationen mittels Exom-Sequenzierung, SNPchip-basierter Kopplungsanalyse, DNA-Microarray und Sanger-Sequenzierung bei zehn betroffenen Individuen aus vier unabhängigen Familien. Die Betroffenen weisen Arthrogrypose, Hypotonie, respiratorische Insuffizienz bei der Geburt, Skoliose und verzögerte motorische Entwicklung auf. Dieser Phänotyp unterscheidet sich deutlich von der distalen Arthrogrypose mit Augenanomalien, die autosomal dominante distale Arthrogrypose 3 (DA3), distale Arthrogrypose 5 (DA5) und dem Marden-Walker-Syndrom (MWKS) kennzeichnen. Während diese Erkrankungen durch heterozygote Gain-of-function-Mutationen in PIEZO2 verursacht werden, führen die hier neu beschriebenen Mutationen zum Verlust von PIEZO2, da sie in von Patienten abgeleiteten Fibroblasten-Zelllinien zu einem Nonsense-mediated mRNA Decay führen. PIEZO2 ist ein mechanosensitiver Ionenkanal, der eine wichtige Rolle bei der Wahrnehmung von leichten Berührungen und der Propriozeption spielt. Mäuse, denen PIEZO2 ubiquitär fehlt, sterben postnatal an Atemnot, während Individuen, denen PIEZO2 fehlt, eine neuromuskuläre Störung entwickeln, die wahrscheinlich auf den Verlust der Propriozeption in den Muskeln zurückzuführen ist. Für VAMP1 haben wir mittels Exom- oder Genomsequenzierung bei zwei Geschwisterpaaren aus zwei unabhängigen Familien, die von einem neuartigen kongenitalen myasthenischen Syndrom betroffen sind, biallelische Loss-of-function-Mutationen identifiziert. Die elektrodiagnostische Untersuchung ergab stark erniedrigte zusammengesetzte Muskelaktionspotenziale und präsynaptische Beeinträchtigungen. Bei den beiden beschriebenen homozygoten Mutationen handelt es sich um eine Frameshift-Mutation und eine missense Mutation einer hochkonservierten Aminosäure, die wahrscheinlich zu einem Verlust der Funktion von VAMP1 führen. Der Phänotyp ähnelt dem der VAMP1lew/lew-Mäuse, die eine homozygote VAMP1 trunkierende Mutation tragen und neurophysiologische Merkmale einer präsynaptischen Beeinträchtigung aufweisen. Für CAPRIN1 identifizierten wir die identische de novo c.1535C>T (p.Pro512Leu) missense Variante mit Hilfe der Trio-Exom-Sequenzierung bei zwei nicht verwandten Personen, die eine früh einsetzende Ataxie, Dysarthrie, kognitiven Abbau und Muskelschwäche aufweisen. Diese Mutation führt zur Substitution einer hochkonservierten Aminosäure und in silico-Tools sagen eine erhöhte Aggregationsneigung des Proteins voraus. Die Überexpression von CAPRIN1-P512L führte zur Bildung unlöslicher ubiquitinierter Aggregate, die Proteine sequestrieren, die mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden, wie ATXN2, GEMIN5, SNRNP200 und SNCA. Nach der Differenzierung in kortikale Neuronen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC), in denen die CAPRIN1-P512L Mutation mittels CRISPR/Cas9 eingeführt wurde, wurde in diesen Linien eine verringerte neuronale Aktivität und eine veränderte Dynamik der Stressgranula beobachtet. Darüber hinaus ergab die Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie, dass CAPRIN1-P512L eine verlängerte Konformation annimmt, und die Fluoreszenzmikroskopie zeigte, dass die RNA seine Aggregation in vitro stark fördert. Insgesamt assoziiert diese Studie: (1) biallelische Loss-of-function-Mutationen in PIEZO2 mit der autosomal rezessiven distalen Arthrogrypose mit beeinträchtigter Propriozeption und Tastsinn; (2) biallelische Loss-of-function-Mutationen in VAMP1 mit einem autosomal rezessiven präsynaptischen kongenitalen myasthenischen Syndrom; (3) eine wiederkehrende de novo p. Pro512Leu-Mutation von CAPRIN1 mit einer neurodegenerativen Störung, die durch Ataxie und Muskelschwäche gekennzeichnet ist. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Delle Vedove, Andrea dellevedovea.md@gmail.com orcid.org/0000-0003-4771-9808 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-650643
Date:	11 January 2023
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences Faculty of Medicine
Divisions:	Zentrum für Molekulare Medizin
Subjects:	Natural sciences and mathematics Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Rare Diseases English Neuromuscular Diseases English Next Generation Sequencing English Distal Arthrogryposis English Congenital Myasthenic Syndrome English Ataxia English
Date of oral exam:	20 December 2022
Referee:	Name Academic Title Beyer, Andreas Prof. Dr. Hofmann, Kay Prof. Dr.
Funders:	FP7/2007-2013 under agreement 2012-305121 (NEUROMICS), Deutsche Forschungsgemeinschaft (Wi945-19.1)
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/65064