Veränderungen des Plasmamembran-Proteoms in AP-2-depletierten HeLa-Zellen

Tobys, David Christian ORCID: 0000-0001-5528-6059 (2022). Veränderungen des Plasmamembran-Proteoms in AP-2-depletierten HeLa-Zellen. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Die Clathrin-vermittelte Endozytose (engl. clathrin-mediated endocytosis, CME) ermöglicht infolge einer Einstülpung der Plasmamembran und Ausbildung Protein-beschichteter Vesikel die zelluläre Aufnahme einer Vielzahl unterschiedlicher Membranproteine sowie ihrer Liganden. Zugleich nimmt die CME einen regulatorischen Einfluss auf die Zusammensetzung der Plasmamembran und wirkt sich in dieser Weise auf eine Vielzahl weiterer Zellprozesse aus. Insgesamt mehr als 50 ursprünglich aus dem Zytoplasma stammende Proteine sind im Zuge der CME an der Ausbildung der Vesikelhülle beteiligt, innerhalb derer der heterotetramere Adaptorkomplex AP-2 eine Schlüsselposition einnimmt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die CME unter Anwendung eines siRNA (engl. small interfering RNA, dt. kleine eingreifende RNS) -vermittelten Knockdowns (KD) der µ2-Untereinheit von AP-2 inhibiert und hieraus resultierende Veränderungen in Bezug auf die Endozytose unterschiedlicher Klassen von Membranproteinen untersucht. Hierbei stand die mittels quantitativer Massenspektrometrie erhobene Analyse des Plasmamembran-Proteoms µ2-depletierter HeLa-Zellen im Zentrum dieser Arbeit. Eine darüberhinausgehende Untersuchung einzelner Membranproteine erfolgte mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie sowie unter Anwendung weiterer biochemischer und molekularbiologischer Methoden. Die gewonnenen Daten ergaben eine mindestens anderthalbfache Akkumulation mehr als der Hälfte aller identifizierten Proteine an der Plasmamembran µ2-depletierter HeLa-Zellen. Insbesondere zeigte sich eine starke Anreicherung endosomaler und lysosomaler Proteine sowie bestimmter Integrine. Funktionell äußerte sich Letzteres in einer deutlich beeinträchtigten Zellmigration. Darüber hinaus resultierte der im Rahmen dieser Arbeit angewandte µ2-KD in einer Plasmamembrananreicherung bekannter Tumormarker (CD73, CD164, CD302) sowie des mit soliden Tumoren assoziierten Metalloenzyms Carboanhydrase 9 (CA9), das einen möglichen Angriffspunkt für eine zielgerichtete antitumorale Therapie darstellt und die insgesamt stärkste Akkumulation aller Membranproteine erfuhr. Des Weiteren konnte das bislang nicht charakterisierte Membranprotein SMIM29 (engl. small integral membrane protein 29; Synonym: c6orf1) erstmals als ein Protein identifiziert werden, das mehrere funktionale Sortierungssignale aufweist und dessen Internalisierung mittels CME erfolgt. Ferner konnte neben der quantitativen Proteom-Analyse eine Hemmung der endozytotischen Gesamtleistung in AP-2-depletierten HeLa-Zellen nachgewiesen werden, während die Funktionsfähigkeit Clathrin-unabhängiger Endozytosewege (engl. clathrin-independent endocytosis, CIE) kaum beeinträchtigt war.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Creators:

Creators	Email	ORCID	ORCID Put Code
Tobys, David Christian	david.tobys@uk-koeln.de	orcid.org/0000-0001-5528-6059	UNSPECIFIED

Contributors:

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Author in quotations or text extracts	Kowalski, Lisa Maria	l.kowalski@uni-koeln.de
Author in quotations or text extracts	Cziudaj, Eva	eva.cziudaj@uk-koeln.de
Author in quotations or text extracts	Müller, Stefan	stefan.mueller@uni-koeln.de
Author in quotations or text extracts	Zentis, Peter	peter.zentis@uni-koeln.de
Author in quotations or text extracts	Pach, Elke	elke.pach@uk-koeln.de
Author in quotations or text extracts	Zigrino, Paola	paola.zigrino@uni-koeln.de
Author in quotations or text extracts	Bläske, Tobias	tobias.blaeske@uni-konstanz.de
Author in quotations or text extracts	Höning, Stefan	shoening@uni-koeln.de