Universität zu Köln

Knyphausen, Philipp (2016). Post-translational lysine-acetylation of Ran and its regulation by Sirtuin deacetylases. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Through recent advances in high-throughput mass spectrometry it has become evident that post-translational N-(epsilon)-lysine-acetylation is a modification found on thousands of proteins of all cellular compartments and all essential physiological processes. Many aspects in the biology of lysine-acetylation are poorly understood, including its regulation by lysine-acetyltransferases and lysine-deacetylases (KDACs). Here, the role of this modification was investigated for the small GTP-binding protein Ran, which, inter alia, is essential for the regulation of nucleocytoplasmic transport. To this end, site-specifically acetylated Ran was produced in E. coli by genetic code expansion. For five previously identified sites, Ran acetylation was tested regarding its impact on the intrinsic GTP hydrolysis rate, the assembly of export complexes (modeled in vitro with the export receptor CRM1 and the export substrate Spn1) and the interaction of Ran with its GTPase activation protein RanGAP and RanBP1. Overall, mild effects of Ran acetylation were observed for intrinsic and RanGAP-stimulated GTP hydrolysis rates. The interaction of active Ran with RanBP1 was negatively influenced by Ran acetylation at K159. Moreover, CRM1 bound to Ran acetylated at K37, K99 or K159 interacted more strongly with Spn1. Thus, lysine-acetylation interferes with essential aspects of Ran function. An in vitro screen was performed to identify potential Ran KDACs. The NAD+-dependent KDACs of the Sirtuin class showed activity towards two acetylation sites of Ran, K37 and K71. The specificity of Sirtuins was further analyzed based on an additional Ran acetylation site, K38. Since deacetylation of RanAcK38 was much slower compared to RanAcK37, di-acetylated RanAcK37/38 was tested next. The deacetylation rate of di-acetylated Ran was comparable to that of RanAcK37. Deacetylation experiments under single turnover conditions revealed that deacetylation occurs first at the K38 site in the di-acetylated RanAcK37/38 background. The ability of Sirtuins to deacetylate two adjacent AcKs was further investigated based on two proteins, which had previously been found to be di-acetylated and targeted by Sirtuins, namely the tumor suppressor protein p53 and phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (PEPCK1). p53 was readily deacetylated at two di-acetylation sites (K372/372 and K381/382), whereas PEPCK1 was not deacetylated in vitro. Taken together, these results have important implications for the substrate specificity of Sirtuins.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Durch die Fortschritte in der Hochdurchsatz-Massenspektrometrie hat sich gezeigt, dass posttranslationale N-(epsilon)-Lysin-Acetylierung bei Tausenden von Proteinen vorkommt. So modifizierte Proteine finden sich beim Menschen und anderen Organismen in allen Zellkompartimenten und sind in vielen Fällen an essentiellen zellulären Prozessen beteiligt. Viele Aspekte posttranslationaler Lysin-Acetylierung sind jedoch nur unvollständig verstanden, einschließlich ihrer Regulierung durch Lysin-Acetyltransferasen und Lysin-Deacetylasen (KDACs). In dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss diese Modifikation auf die Funktion des kleinen GTP-bindenden Proteins Ran hat, dem in der Zelle unter anderem eine zentrale Rolle bei der Regulation des Kerntransports zukommt. Hierzu wurde mit Hilfe eines erweiterten genetischen Codes stellenspezifisch acetyliertes Ran in E. coli hergestellt. Untersucht wurden zunächst fünf zuvor identifizierte Ran-Acetylierungsstellen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die intrinsische GTP-Hydrolyse Rate von Ran, die Bildung von Exportkomplexen (anhand des Exportrezeptors CRM1 und des Exportsubstrats Spn1) und die Interaktion von Ran mit RanBP1 und dem GTPase-aktivierenden Protein RanGAP. Insgesamt waren sowohl bei der intrinsischen als auch der RanGAP-stimulierten GTP-Hydrolyse nur schwache Effekte zu messen. Dahingegen sorgte die Acetylierung von Ran am Lysin 159 (K159) für eine deutlich gesenkte Anita ̈t von Ran zu RanBP1, wenn Ran im aktiven Zustand vorlag. Darüberhinaus war eine stärkere Bindung von Spn1 an einen Komplex aus CRM1·Ran zu beobachten, wenn Ran an den Stellen K37, K99 oder K159 acetyliert war. Anhand dieser Ergebnisse lässt sich schließen, dass wesentliche Funktionen des Proteins Ran durch Acetylierung beeinflusst werden. Ein in vitro Screen wurde durchgeführt, um potenzielle KDACs für Ran zu identifizieren. NAD+-abhängige KDACs der Sirtuin-Klasse zeigten Aktivität gegenüber zwei Acetylierungsstellen von Ran, K37 und K71. Die Spezifität der SIRTs wurde daraufhin anhand einer weiteren acetylierten Variante von Ran (RanAcK38) analysiert. Da bei RanAcK38 im Vergleich zu RanAcK37 eine deutlich langsamere Deacetylierungsrate zu beobachten war, wurde als nächstes di-acetyliertes Ran-AcK37/38 getestet. Die Deacetylierungsrate von di-acetylierten Ran war erstaunlicherweise vergleichbar mit derjenigen von RanAcK37. Deacetylierungsexperimente unter single turnover-Bedingungen ergaben, dass die Deacetylierung im Ran-AcK37/38-Hintergrund als erstes an der Stelle K38 erfolgen muss. Die Fähigkeit von Sirtuinen zwei benachbarte AcKs zu deacetylieren wurde schließlich anhand zweier weiterer Proteine untersucht, von denen bekannt war, dass sie unter anderem di-acetyliert vorkommen. Dabei handelte es sich um das Tumorsuppressor-Protein p53 und Phosphoenolpyruvatcarboxykinase 1 (PEPCK1). Es stellte sich heraus, dass p53 an zwei Di-Acetylierungsstellen (K372/372 und K381/382) durch Sirtuin 1 und 2 deacetyliert wird. Entgegen der Erwartungen war bei PEPCK1 keine Deacetylierung durch Sirtuine festzustellen. Diese Ergebnisse lassen einige bedeutende Schlussfolgerungen für die Substratspezifität von Sirtuinen zu. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Knyphausen, Philipp philipp.knyphausen@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-66890
Date:	2016
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Sirtuin deacetylases, Nuclear Transport, Lysine-acetylation, p53, PEPCK1 English
Date of oral exam:	20 January 2016
Referee:	Name Academic Title Lammers, Michael Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6689