Molecular Genetics of Primary Microcephaly and Microcephalic Primordial Dwarfism in Consanguineous Families from Pakistan

Ahmad, Ilyas (2016). Molecular Genetics of Primary Microcephaly and Microcephalic Primordial Dwarfism in Consanguineous Families from Pakistan. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

The centrosome is known as the coordinator of key organizational processes of a cell. Mutations in genes of centrosome associated proteins have been found to cause primary microcephaly (MCPH) or related growth pathologies such as microcephalic primordial dwarfism syndromes in humans. Defects in mitotic progression, chromosome segregation, microtubule assembly and DNA damage-induced checkpoint arrests are the proposed links for the underlying mechanisms. Genes that are part of networks involved in the regulation of the cell cycle can be potential candidates for both diseases. To identify new genes involved in the disease process, twenty nine consanguineous MCPH families and a family with microcephalic primordial dwarfism were recruited from various areas of Pakistan. Homozygosity mapping complemented with exome sequencing or targeted gene sequencing identified several mutations in known MCPH associated genes and in a new gene, PLK4. In case of MCPH, mutations were identified in 28 families linked to known loci. In one family sequencing of the whole exome failed to detect a mutation, suggesting the involvement of regulatory regions. Nine novel mutations were found in ASPM, two in MCPH1 and two in CDK5RAP2. Three known mutations were found in ASPM and one in WDR62. Furthermore, the exact breakpoints were mapped in two families carrying overlapping homozygous microdeletions of 164 kb and 577 kb at the MCPH1 locus. A biallelic loss-of-function mutation, p.Arg936Serfs*1, was identified near the C-terminus of PLK4 in a family segregating inherited microcephalic primordial dwarfism. PLK4 kinase is an essential regulator of centriole biogenesis. Cellular experiments carried out with patient-derived fibroblasts demonstrated a significant reduction at the protein level. Centriole biogenesis was significantly impaired and resulted in monopolar configurations, centriole loss and defective spindle formation. Further, overexpression studies revealed that mutant PLK4 still localized to the centrosome but centriole duplication was significantly impaired. Moreover, patient cells showed a reduced cellular proliferation and delayed mitotic progression. Combining genetic data with the results of cellular experiments, PLK4 was established as a new disease-associated gene in microcephalic primordial dwarfism. This study adds to the mutational spectra of MCPH-associated genes and quantifies the genetic heterogeneity in the Pakistani population. It further confirms the importance of the centrosome for normal brain and body size and extends the genetic understanding and phenotypic spectrum associated with genes relevant for centriole biogenesis.

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Thesis (PhD thesis)

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Abstract

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Zentrale organisatorische Prozesse der Zelle werden vom Zentrosom koordiniert. Tragen die Gene, die für zentrosomassoziierte Proteine kodieren, Mutationen, so kann das zu primärer Mikrozephalie (MCPH) oder ähnlichen Wachstumsstörungen, wie z. B. den mikrozephalen primordialen Kleinwuchssyndromen (MPD), führen. Die zugrundeliegenden Defekte führen zu Störungen der mitotischen Progression, der Chromosomensegregation und der Mikrotubuli-Anordnung sowie zu Arretierungen an Zellzykluskontrollpunkten, die mit DNA-Schäden im Zusammenhang stehen. Grundsätzlich sind alle Gene für Komponenten von Netzwerken, die den Zellzyklus regulieren, potentielle Kandidaten für die Verwicklung in die Ausprägung derartiger Erkrankungen. Um neue involvierte Gene zu identifizieren, wurden 29 konsanguine MCPH-Familien und eine MPD-Familie aus verschiedenen Regionen Pakistans rekrutiert. Mit Hilfe von Homozygotie-Kartierungen ergänzt mit Exom- bzw. Kandidatengen-Sequenzierungen konnten verschiedene Mutationen in bekannten MCPH-assoziierten Genen sowie in einem neuen Gen (PLK4) identifiziert werden. Bezogen auf MCPH wurden in 28 Familien, die mit bekannten Loci koppelten, Mutationen gefunden. In einer Familie konnte die kausale Mutation trotz der Sequenzierung des gesamten Exoms nicht detektiert werden. Hier könnte die Mutation in einer der nicht erfassten regulatorischen Regionen liegen. Es wurden zahlreiche neue Mutationen gefunden, neun in ASPM, zwei in MCPH1 und weitere zwei in CDK5RAP2. Weiterhin wurden drei bekannte Mutationen in dem Gen ASPM und eine bekannte Mutation in WDR62 gefunden. Darüber hinaus konnten in zwei Familien die genauen Bruchpunkte einer 164-kb- und einer 577-kb-Deletion am MCPH1-Locus kartiert werden, die einander überlappten und in den jeweiligen Familien homozygot vorlagen. In der MPD-Familie wurde in der Nähe des C-Terminus von PLK4 die biallelische Funktionsverlustmutation p.Arg936SerFs*1 identifiziert. Die PLK4-Kinase ist ein essentieller Regulator der Centriol-Biogenese. Fibroblastenzellen von betroffenen Probanden wiesen eine signifikant reduzierte Proteinmenge auf. Außerdem war die Centriol-Biogenese stark beeinträchtigt. Dies resultierte in monopolaren Strukturen, einem Verlust von Centriolen und einer fehlerhaften Spindelbildung. Des Weiteren haben Überexpressionsstudien gezeigt, dass das mutierte PLK4-Protein zwar noch zum Zentrosom lokalisiert, jedoch die Fähigkeit der Kinase, die Centriol-Duplikation zu befördern, signifikant eingeschränkt ist. Darüber hinaus zeigten die Patientenzellen eine reduzierte Proliferation und eine verzögerte mitotische Progression. Die genetischen Daten zusammen mit den Resultaten der zellulären Experimente haben PLK4 überzeugend als ein neues MPD-assoziiertes Gen etabliert. Die vorliegende Studie erweitert die Mutationsspektren einiger MCPH-assoziierter Gene und quantifiziert die genetische Heterogenität in der Pakistanischen Bevölkerung hinsichtlich der untersuchten seltenen Erkrankungen. Diese Arbeit bestätigt außerdem die große Bedeutung der Zentrosomenfunktion für eine normale Gehirnentwicklung und Körpergröße. Sie erweitert ferner unser Wissen über die für die Centriol-Biogenese relevanten Gene sowie das phänotypische Spektrum, das mit diesen assoziiert sein kann.

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