Patterns of micro-RNAs, their target pathways, and non-canonical functions of miR regulating proteins in T-prolymphocytic leukemia

Braun, Till Jonas (2023). Patterns of micro-RNAs, their target pathways, and non-canonical functions of miR regulating proteins in T-prolymphocytic leukemia. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

T-prolymphocytic leukemia (T-PLL) is an aggressive and refractory mature T-cell neoplasm with currently very limited therapeutic options. The current disease concept is centered around cooperative perturbations of TCL1A and ATM, leading to enhanced T-cell receptor signaling as well as aberrant DNA repair mechanisms. We recently described recurrent gains on chromosome 8q, that frequently involve the AGO2 gene. In a variety of malignancies, AGO2 was assigned an oncogenic role by mediating microRNA (miR) processing. Here, we present an integrated multi-level dataset of 46 T-PLL patients, demonstrating overexpression of AGO2 in a majority of T-PLL cases. This overexpression was associated with a larger tumor burden as well as a higher proliferation capacity in vitro, indicating an oncogenic role of AGO2 in the leukemogenesis of T-PLL. In addition to pro-oncogenic miR-ome/transcriptome networks shaped by AGO2, we demonstrate a previously undescribed relationship between TCR signaling and AGO2. In-vitro systems of transiently modulated AGO2 protein expression demonstrated an enhancing role of AGO2 on the phosphor-activation of the TCR upstream-kinases ZAP70, PLCγ1, and LAT. Notably, these effects were mediated by direct protein-protein interactions, as shown by interactions with LCK and ZAP70 in global mass-spectrometry analysis and proximity ligation assays in TCR-activated cells. Subsequent models of three-dimensional structures revealed a membranous protein complex formation, requiring post-transcriptional modifications of AGO2 by LCK. In addition to a global perturbation of the ‘miR-master regulator’ AGO2, we showed a T-PLL specific miR expression signature, consisting of 34 miRs, which presented a differential expression in T-PLL compared to pan T-cells of age-matched healthy donors. Importantly, these miR signatures revealed the influence of constitutive TCR activation. Most prominently, two major subgroups of T-PLL cases were defined by the expression of the miR-141 and miR-200c cluster. In addition, more aggressive presentations of T-PLL were associated with increased expression of miR-223-3p and reduced expression of miR-21 as well as the miR-29 cluster. In an integrative approach of miR as well as mRNA sequencing, we were able to uncover regulatory networks, mainly shaping DNA damage response and survival pathways. We, finally, developed a combinatorial miR-based overall survival score, further highlighting the pathobiological impact of AGO2 and miR-ome perturbations.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Die T-Prolymphozytenleukämie (T-PLL) ist eine aggressive und refraktäre, reifzellige T-Zell- Neoplasie mit derzeit sehr begrenzten therapeutischen Möglichkeiten. Das Krankheitskonzept basiert auf einer kooperativen Störung von TCL1A und ATM, die zu einer verstärkten T-Zell-Rezeptor (TZR) Aktivierung sowie zu aberranten DNA-Reparaturmechanismen beiträgt. Wir haben kürzlich wiederkehrende Amplifikationen auf Chromosom 8q beschrieben, die häufig das AGO2-Gen betreffen. Bei einer Reihe von Malignomen wurde AGO2 eine onkogene Rolle zugeschrieben, indem es zu einer dysregulierten Verarbeitung von microRNAs (miRs) kommt. Hier stellen wir einen integrierten Mehrebenen-Datensatz von 46 T-PLL-Patienten vor, der eine Überexpression von AGO2 in der Mehrheit der T-PLL Fälle zeigt. Diese Überexpression war mit einer größeren Tumorlast sowie einer höheren Proliferationsfähigkeit in vitro verbunden, was auf eine onkogene Rolle von AGO2 bei der Leukämogenese der T-PLL hinweist. Zusätzlich zu pro-onkogenen miR-om/Transkriptom-Netzwerken, die von AGO2 bestimmt werden, zeigen wir eine bisher unbeschriebene Beziehung zwischen dem TZR-Signalweg und AGO2. In-vitro Systeme mit transient modulierter AGO2-Proteinexpression zeigten eine verstärkende Rolle von AGO2 bei der Phospho-Aktivierung der TCR-Kinasen ZAP70, PLCγ1 und LAT. Diese Effekte wurden durch direkte Protein-Protein-Interaktionen vermittelt, wie Interaktionen mit LCK und ZAP70 in Massenspektrometrie-Analysen und Proximity Ligation Assays in TCR-aktivierten Zellen zeigten. Nachfolgend postulierte Modelle drei-dimensionaler Strukturen dieser Interaktionen sagen eine membranöse Proteinkomplexbildung, die eine post-transkriptionelle Modifikation von AGO2 durch LCK erfordert, voraus. Zusätzlich zu einer globalen Störung des "miR-Master-Regulators" AGO2 zeigen wir ein T-PLL-spezifisches miR-Expressionsprofil mit 34 signifikant deregulierten miRs. Wichtig ist, dass diese miR-Signaturen den Einfluss der konstitutiven TCR-Aktivierung aufzeigen. Vor allem wurden zwei große Untergruppen von TPLL-Fällen durch die Expression der miR-141- und miR-200c-Cluster definiert. Darüber hinaus waren aggressivere Formen bzw. Phasen der T-PLL mit einer erhöhten Expression von miR-223-3p und einer reduzierten Expression von miR-21 sowie des miR-29 Clusters assoziiert. Mit einem integrativen Ansatz der miR- und mRNA Sequenzierung konnten wir regulatorische Netzwerke aufdecken, die hauptsächlich die DNA-Schadensreaktion und Überlebenswege beeinflussen. Schließlich haben wir einen kombinatorischen miR-basierten Prognose-Score zum Gesamtüberleben entwickelt, der die pathobiologischen Auswirkungen von AGO2- und miR Störungen auf die T-PLL weiter verdeutlicht.

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